生命システムの解明を目指した線虫のペプチド大量シーケンスと機能解析
对秀丽隐杆线虫肽进行大规模序列和功能分析以阐明生命系统
基本信息
- 批准号:12202035
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- 依托单位:
- 依托单位国家:日本
- 项目类别:Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
- 财政年份:2000
- 资助国家:日本
- 起止时间:2000 至 无数据
- 项目状态:已结题
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项目摘要
本研究では,線虫C.elegansの生理活性ペプチドの効率的な抽出法の確立と単離を行い,その一部についてアミノ酸配列決定を行った。【線虫の大量調製】プレート法および液体培養法により線虫C.elegansの幼虫および成虫を約100g調製した。【ペプチド画分の精製】線虫を液体窒素中で粉砕し,冷アセトンで脱脂後,80%エタノールで低分子ペプチドを抽出した。さらに,2%食塩水を用いて残さより高分子ペプチドを抽出した。それぞれのペプチド画分を熱処理してタンパク分解酵素を失活させ,イオン交換樹脂を用いて中性,酸性,塩基性画分に大別した。さらに,酸性および塩基性画分についてはイオン強度によりペプチドを細分化した。それぞれの画分について逆相HPLCで分析した結果,良好な分離パターンが得られた。よって,上記の方法により,ペプチドを迅速に単離できると考えられる。さらに,幼虫期および成虫期由来のペプチドでは分離パターンが著しく異なることから,発育段階別にペプチド精製を行うことが極めて有効であると考えられる。【ペプチドの単離】逆相HPLC分析で比較的単離し易いと思われる20種のペプチドについて,イオン交換および逆相HPLCを組み合わせることにより,精製単離した。現在,さらなるペプチドの単離操作を行っている。【アミノ酸配列決定】単離したペプチドの分子量をESI-TOF-MSを用いて測定した。次いで,アミノ酸配列分析を行った。アミノ酸配列が得られたペプチドについて,部分配列,分子量をもとに線虫のデータベース検索を行うことにより,全一次配列を決定した。N末端修飾によりアミノ酸配列が得られなかったペプチドについては,MS-MSによる配列決定を行っている。
在本研究中,我们建立并分离了一种从线虫中高效提取生物活性肽的方法,并测定了其中一些生物活性肽的氨基酸序列。 [线虫的大规模制备] 采用平板法和液体培养法制备线虫幼虫和成虫约100g。 [肽级分的纯化] 将线虫在液氮中粉碎,用冷丙酮脱脂,用80%乙醇提取低分子量肽。此外,使用2%盐水从残留物中提取高分子量肽。每个肽级分均经过热处理以使蛋白水解酶失活,然后使用离子交换树脂分为中性、酸性和碱性级分。此外,肽根据酸性和碱性部分的离子强度细分。通过反相HPLC分析各级分,结果得到良好的分离模式。因此,认为上述方法可以快速分离肽。此外,由于来自幼虫和成虫阶段的肽的分离模式明显不同,因此认为在每个发育阶段纯化肽是极其有效的。 [肽的分离] 通过离子交换和反相HPLC的组合,对20种被认为相对容易通过反相HPLC分析分离的肽进行纯化和分离。我们目前正在努力分离其他肽。 [氨基酸序列测定] 使用ESI-TOF-MS测定分离的肽的分子量。然后,进行氨基酸序列分析。对于获得氨基酸序列的肽,根据部分序列和分子量,通过检索秀丽隐杆线虫数据库确定完整的一级序列。对于因N端修饰而无法获得氨基酸序列的肽,通过MS-MS进行测序。
项目成果
期刊论文数量(2)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Kusano,M.,Koshino,H.,Uzawa,J.,Fujioka,S.Kawano,T.,and Kimura,Y.: "Nematicidal alkaloids and related compounds produced by the fungus Penicillium cf.simplicissimum"Bioscience,Biotechnology and Biochemistry. 64. 2559-2568 (2000)
Kusano,M.、Koshino,H.、Uzawa,J.、Fujioka,S.Kawano,T. 和 Kimura,Y.:“真菌青霉 cf.simplicissimum 产生的杀线虫生物碱和相关化合物”生物科学、生物技术和生物化学
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Kawano,T.,Ito,Y.,Ishiguro,M.,Takuwa,K.,Nakajima,T.,and Kimura,Y.: "Molecular cloning and characterization of a new insulin/IGF-like peptide of the nematode Caenorhabditis elegans"Biochemical and Biophysical Research Communications. 273. 431-436 (2000)
Kawano,T.、Ito,Y.、Ishiguro,M.、Takuwa,K.、Nakajima,T. 和 Kimura,Y.:“线虫新胰岛素/IGF 样肽的分子克隆和表征
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