トリプレット・リピート増幅細胞の酸化ストレス脆弱性

三重重复扩增细胞的氧化应激脆弱性

基本信息

批准号：
12050213
负责人：
笹川昇
金额：
$ 2.3万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

筋強直性ジストロフィー(DM)は、その遺伝子変異がタンパク質をコ-ドする領域に無いにも関わらず、優性遺伝の形式で発症する。責任遺伝子DM protein kinase(DMPK)の3'側非翻訳領域には(CTG)トリプレット・リピートがあり、正常対照に比べて患者ではリピート数が増幅していることが知られている。近年、DM発症機構として「RNA機能獲得(RNA gain of function)」という新しい概念が提唱されている。これはCTG(転写されるとCUG)リピートが伸長すると、mRNAがRNA結合タンパク質と相互作用するなどの新たな機能を獲得し、結果として発症につながるというものである。私は人工的に(CTG)リピート配列を増幅させる技術を既に確立しており、マウス筋芽細胞C2C12株にリピートの伸長したヒトDMPKを導入し、安定に発現させる系(DMモデル細胞)を保持している。今回、このモデル細胞に過酸化水素、メナジオンといった酸化剤を与え、その感受性を検討したところ、リピートが増幅したモデル細胞で有意に酸化ストレスに対する高感受性が観察された。今回の実験はリピートの長さが正常である以外は全く同条件のモデル細胞を対照にしていることから、今回見出された酸化ストレス脆弱性がリピートの増幅によって特異的に起こっていることが示唆された。また、このモデル細胞は過剰発現系であるため、この結果は先に述べた「RNA機能獲得」を支持するものと思われた。次に、私はリピート伸長及び酸化ストレスによつて起こる変化を遺伝子レベルで特定するため、DNAマイクロアレイ解析をおこなった。その結果、酸化ストレスを与える以前から、リピートが増幅しているだけで既に発現変化している遺伝子が存在することを見出した。現在これらの遺伝子の発現変化を裏付けるべく、ノーザン解析を行っている最中である。

尽管遗传突变不在蛋白质覆盖的区域，但肌肉强营养不良（DM）以主要遗传形式发展。负责的基因DM蛋白激酶（DMPK）3'侧翻译已经知道，与正常对比度相比，患者的重复次数被扩增。近年来，已提出了一种新的“功能RNA获得的概念）作为DM发作机制。这意味着，当CTG（CUG）重复时，重复是获取新功能，例如与RNA结合蛋白的相互作用，从而导致发作。我已经建立了一项技术，可以人为地放大（CTG）重复阵列，并保持了一个将重复的人DMPK引入小鼠肌肉刺激细胞C2C12菌株的系统，并维持一个稳定表达的系统（DM模型） '我这样做。这次，在模型细胞中显着观察到一种氧化剂，例如过氧化氢和Menageon，并检查灵敏度，并通过重复重复进行了重复。在此实验中，重复的长度与具有相同条件的模型细胞完全对比，因此由于重复的扩增，发现了这次发现的氧化脆弱性。另外，由于该模型细胞过度表达，因此认为该结果支持上述“ RNA函数获取”。接下来，我进行了DNA Microalley分析，以确定遗传水平上的重复生长和氧化应激引起的变化。结果，我们发现在重复之前已经放大了一个基因在给出氧化应激之前已经在表达上发生了变化。目前，我们正在进行北部分析，以支持这些基因表达的变化。