一分子観察によるF.モーターの回転と酵素反応ステップの関係の解明

F. 通过单分子观察阐明电机旋转与酶反应步骤之间的关系

基本信息

批准号：
12030210
负责人：
宗行英朗
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12030210/
关键词：
一分子観察 ATP合成酵素 F_1-ATPase モータータンパク質

项目摘要

F_1モーターの回転機構を解明するために以下の研究を行った.昨年度,結晶構造から,残基番号181のGly残基がヌクレオチドの有無によって大きく二面角を変化させる事を発見し,これをAlaに変異させると,F_1-ATPaseに特徴的なADP・Mgによる阻害状態に陥りにくくなることを発見した.このADP・Mgによる特異的阻害状態は,F_1モーターの回転機構を解析する上で大きな障害となる.そこで,この変異と165番目のThrをSerに置換する変異を同時に導入して,阻害を受けにくい変異体を作成した.更に,ヌクレオチド結合を容易に観察するために触媒部位付近にTrpを導入した.これらの変異を導入したF_1モーターは,狙い通り,きわめてADP・Mgによる阻害を受けにくくなり,1mMのADP共存下でも容易に回転の一分子観察を行うことができた.このことは,従来不可能であったATPの加水分解の自由エネルギーを広い範囲で制御した条件下での回転観察が可能になったことを意味する.この変異体を用いて,一分子が一動作で行う力学的仕事と統計的性質を持つ入力の自由エネルギーの関係を明らかにしてゆく予定である.またストップトフローを用いた予備的な実験で,ATPの結合のキネティクスを追跡できることを確認している.次に生体分子によるエネルギー変換について理解するために,二つの反応が双方向的・可逆的に共役するモデルを考案し,計算機シミュレーションによってその振る舞いを検討した.その結果,簡単な仮定に基づき,入力・出力の反応の起こる回数の比が非整数で可変と言う性質の得られるモデルができた.これが実際の蛋白質によるエネルギー変換機構とどのような関わりを持つかについても今後考察を深めて行きたい.

为了阐明F_1电动机的旋转机制，我们进行了以下研究。去年，我们发现具有181个残基的GLY残基会根据核苷酸的存在或不存在明显改变二面角，并且当将其突变为ALA时，很难落入ADP和MG的抑制状态，F_1-ATPase的特征。 ADP和MG的特定抑制状态用于分析F_1电动机的旋转机理。这是一个主要障碍。因此，同时引入了该突变和一个用SER代替165th的突变，以创建一个突变体，而突变体不太可能被抑制。此外，在催化位点附近引入了TRP，以轻松观察核苷酸的结合。引入这些突变的F_1电动机很难被ADP和MG抑制，并且按照预期，即使在1mm ADP存在下，也可以轻松地观察到单个分子旋转。这意味着在已经在多种条件下控制的条件下进行旋转观察，这些条件以前是不可能的。使用该突变体，我们将阐明一个分子在一个动作中的机械工作与具有统计特性的输入的自由能之间的关系。我们还确认，使用停止流的初步实验可以跟踪ATP结合的动力学。接下来，为了了解生物分子的能量转化，我们设计了一个模型，其中两个反应在双向和可逆地共轭，并通过计算机模拟检查了它们的行为。结果，我们创建了一个模型，该模型具有属性的属性，即输入和输出之间发生的反应次数的比率，而输出和变量是非直觉和变量。我们希望将来加深我们的考虑，这与实际蛋白质的能量转化机制如何相关。