古細菌コハク酸脱水素酵素複合体の構造機能解析

古菌琥珀酸脱氢酶复合物的结构和功能分析

• 批准号: 11169237
• 负责人: 岩崎 俊雄
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Nippon Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11169237/
• 关键词: コハク酸脱水素酵素; 呼吸鎖複合体II; 構造機能解析; 鉄硫黄クラスター; X線吸収スペクトル; 電子スピン共鳴; 酸化還元酵素; 結晶化; 古細菌

古細菌スルホロバスのコハク酸脱水素酵素複合体は、4つのサブユニットSdhA,B,C,Dからなり、高い耐熱性を有する。本研究では、古細菌型コハク酸脱水素酵素複合体の構造機能解析を目的として、以下の研究成果を得た。(i)全遺伝子配列決定と各サブユニットの系統解析から、SdhA,Bがミトコンドリア・真正細菌型であり、SdhCがメタン菌フマル酸:チオール酸化還元酵素サブユニットのホモログ、SdhDが新規タンパクであることを見出した。(ii)sdhA-D,sdhAB,sdhB,sdhC,sdhD遺伝子の大腸菌発現系をそれぞれ構築した。その結果、SdhCについては大量発現に成功し、さらにEXAFSおよび共鳴ラマン解析から、鉄および亜鉛を結合すること、少なくとも新規[2Fe-2S]クラスターを有することを見出した。また、EPR解析からSdhCに異方性の高いラジカル中心を見い出したが、同定には至っていない。SdhCは立体構造未知なため、発現酵素を用いた結晶化に着手した。(iii)sdhB遺伝子全長を含むコンストラクトは全て封入体となり、これはシャペロニンGroELSやチオレドキシンとの共発現系によっても状況が改善されなかった。本研究の成果は論文として発表した他、1報投稿中である。また、本課題と関連し、他の酸化還元酵素についても、EPR・EXAFSによる解析を行い、論文として発表した。今後はsdhA-D遺伝子の大腸菌発現系改変を試みるとともに、SdhCの結晶化・機能解析を引続き行う予定である。

古菌Sulfolobus的琥珀酸脱氢酶复合物由SdhA、B、C、D 4个亚基组成，具有较高的热稳定性。在本研究中，我们获得了以下研究成果，旨在分析古菌琥珀酸脱氢酶复合物的结构和功能。 (i) 每个亚基的完整基因测序和系统发育分析表明，SdhA 和 B 是线粒体/真细菌类型，SdhC 是甲烷细菌富马酸：硫醇氧化还原酶亚基的同源物，SdhD 是我发现的一种新蛋白质。 (ii)构建了sdhA-D、sdhAB、sdhB、sdhC和sdhD基因的大肠杆菌表达系统。结果，我们成功表达了大量的SdhC，并且通过EXAFS和共振拉曼分析，我们发现它结合了铁和锌，并且它至少具有一个新颖的[2Fe-2S]簇。此外，通过EPR分析在SdhC中发现了高度各向异性的自由基中心，但尚未被识别。由于SdhC的三维结构未知，我们开始使用表达的酶进行结晶。 (iii)所有含有全长sdhB基因的构建体均形成包涵体，并且这种情况不能通过与伴侣蛋白GroELS或硫氧还蛋白的共表达系统来改善。这项研究的结果已作为论文发表，目前正在提交一份报告。此外，结合该项目，我们使用 EPR 和 EXAFS 分析了其他氧化还原酶，并将其发表在论文中。未来，我们计划尝试改造大肠杆菌sdhA-D基因表达系统，并继续进行SdhC的结晶和功能分析。

项目成果

Iwasaki,T. 他: "Sequence motif-specific assignment of two [2Fe-2S] clusters in rat xanthine oxidoreductase studied by site-directed mutagenesis."J.Biochem.. 127. 771-778 (2000)

Iwasaki, T. 等人：“通过定点诱变研究大鼠黄嘌呤氧化还原酶中两个 [2Fe-2S] 簇的序列基序特异性分配。J.Biochem.. 127. 771-778 (2000)”

Iwasaki, T.: "Respiratory complex II from the thermoacidophilic archaeon, Sulfolobus sp. Strain 7 : genes and protein"Flavins and Flavoproteins 1999. 779-781 (1999)

Iwasaki, T.：“嗜热嗜酸古菌，硫化叶菌属菌株 7 的呼吸复合体 II：基因和蛋白质”黄素和黄素蛋白 1999. 779-781 (1999)

Ishii,M.,Takishita,S.,Iwasaki,T. 他: "Purification and characterization of membrane-bound hydrogenase from Hydrogenobacter thermophilus strain TK-6, an obligately autotrophic, thermophilic, hydrogen-oxidizing bacterium."Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64. 492-

Ishii, M.、Takishita, S.、Iwasaki, T. 等人：“来自嗜热氢杆菌菌株 TK-6（一种专性自养、嗜热、氢氧化细菌）的膜结合氢化酶的纯化和表征。”Biosci.Biotechnol .生物化学.. 64. 492-

Cosper, N. J.: "Structural conservation of the isolated zinc site in archaeal zinc-containing ferredoxins as revealed by X-ray absorption spectroscopic analysis and its evolutionary implications"J. Biol. Chem.. 274. 23160-23168 (1999)

Cosper, N. J.：“通过 X 射线吸收光谱分析揭示古菌含锌铁氧还蛋白中孤立锌位点的结构保守性及其进化意义”J.

堀 弘幸: "NO合成酵素の構造と機能"医学のあゆみ. 188(13). 1113-1115 (1999)

Hiroyuki Hori：“NO合酶的结构和功能”医学史188(13)。