顕微鏡視野内におけるSV40複製反応の直接観察法を用いた分子動態の解明

通过在微观视场内直接观察 SV40 复制反应来阐明分子动力学

基本信息

批准号：
00J10638
负责人：
松浦俊一
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Toyohashi University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

●固定化DNA形態制御技術のDNAポリメラーゼ動態解析への応用本研究では、これまでに開発した技術のうち、(1)疎水性ガラス基板へのDNA分子の片端固定、(2)直流電場によるDNAの形態制御、また(3)酵素活性を保持できる酵素分子の蛍光標識法を真核細胞のDNAポリメラーゼβの動態解析に応用した。DNAポリメラーゼβの蛍光標識では、DNAと複合体を形成した状態で酵素表面のアミノ基に蛍光物質を結合させることによって、酵素活性を保持したまま標識産物を回収することに成功した。蛍光標識DNAポリメラーゼβの比活性が標識前のDNAポリメラーゼに比べて増大したことは、標識過程においてDNA結合活性を有しているDNAポリメラーゼのみが選択的に回収できていることを示唆している。また、標識産物をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した結果、標識前のDNAポリメラーゼβと比較してバンドがシフトアップしたことからDNAポリメラーゼβに蛍光物質が共有結合していることが示された。顕微鏡視野内においてガラス基板に静電的に伸張固定した2本鎖DNAにdNTPとマグネシウムイオンが存在しない条件で蛍光標識DNAポリメラーゼβを作用させたところ、DNA上に結合する様子がみられ、またDNA鎖に沿って直線的にスライディング運動する様子も観察された。次に特定の位置にニックを挿入した2本鎖DNAを用いたところ、DNAポリメラーゼβはニック部分に優先して結合した。また、疎水性ガラス表面に片端固定したあと直流電場によって伸張させたDNAに相互作用するDNAポリメラーゼβの挙動を観測することを試みた。DNaseIによってランダムにニックやギャップを入れたDNAを用いた場合にDNAポリメラーゼβは電界中で伸張するDNAに結合し、20V/cmの直流電界中で遊離することなくDNAに結合した状態を保持した。本研究により開発された疎水性ガラス基板へのDNAの固定化法は、ガラス表面へのDNA分子の非特異的吸着を抑制できるために顕微鏡下でのDNA-酵素間相互作用の解析に有用であると考えられる。また、直流電場によるDNAの形態制御およびDNA結合性酵素の蛍光標識法は、DNAに相互作用する様々なタンパク質(酵素)の動態解析に大きく寄与するものと期待される。

●固定化DNA形态控制技术在DNA聚合酶动力学分析中的应用本研究中，迄今为止开发的技术包括（1）将DNA分子的一端固定在疏水性玻璃基板上，以及（2）使用直流电场的DNA (3)将能够维持酶活性的酶分子的荧光标记应用于真核细胞中DNA聚合酶β的动力学分析。在DNA聚合酶β的荧光标记中，通过将荧光物质与酶表面的氨基结合，同时与DNA形成复合物，我们成功地回收了标记产物，同时保留了酶活性。与标记前的 DNA 聚合酶相比，荧光标记的 DNA 聚合酶 β 的比活性增加，表明在标记过程中只有具有 DNA 结合活性的 DNA 聚合酶被选择性回收。另外，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析标记产物，结果与标记前的DNA聚合酶β相比，条带上移，表明荧光物质与DNA聚合酶β共价结合。在没有 dNTP 和镁离子的情况下，当荧光标记的 DNA 聚合酶 β 应用于静电拉伸并固定在显微镜视野中的玻璃基板上的双链 DNA 时，观察到与 DNA 的结合沿着 DNA 的线性滑动。还观察到了链。接下来，当使用在特定位置插入有切口的双链DNA时，DNA聚合酶β优先与切口结合。我们还尝试观察 DNA 聚合酶 β 与 DNA 相互作用时的行为，DNA 一端固定在疏水性玻璃表面，然后使用直流电场进行拉伸。当使用由 DNaseI 产生的随机切口和间隙的 DNA 时，DNA 聚合酶 β 与在电场中拉伸的 DNA 结合，并在 20 V/cm 的直流电场中保持与 DNA 的结合而不被释放。本研究开发的将DNA固定在疏水性玻璃基板上的方法对于在显微镜下分析DNA-酶相互作用是有用的，因为它可以抑制DNA分子对玻璃表面的非特异性吸附。此外，使用直流电场控制DNA形态和DNA结合酶的荧光标记预计将极大地有助于分析与DNA相互作用的各种蛋白质（酶）的动力学。