マウスを用いた新規視物質遺伝子の導入による色覚高次化機構の解明

阐明通过将新型视觉材料基因引入小鼠增强色觉的机制

• 批准号: 11878160
• 负责人: 河村 正二
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11878160/
• 关键词: ゼブラフィッシュ; 視物質; オプシン; 色覚; GFP; 発現制御; プロモーター; 遺伝子導入

マウスは2種類の錐体視物質を同一の錐体細胞で発現していることが明らかとなり、新規視物質遺伝子の導入による色覚高次化機構の解明には適さないことが明らかになった。そこで対象をゼブラフィッシュのみに絞ることとした。ゼブラフィッシュの桿体視物質遺伝子についてgreen fluorescent protein(GFP)レポーター遺伝子を用いてプロモーター解析をおこなった。桿体視物質遺伝子については隣接上流DNA領域4.2、2.5、1kbを用いてGFP発現誘導能を調べた。各発現コンストラクトをゼブラフィッシュの受精卵にマイクロインジェクションし、それぞれ50%以上の個体で網膜にGFPの発現を確認した。さらに10-30%の個体では脳、おそらく松果体にGFP発現を観察した。4.2kbの上流域コンストラクトを導入した個体約100匹のうち1匹は次世代に発現コンストラクトを伝達した。このことはF1でのゲノムDNAに対するPCR及びサザンハイブリダイゼーションにより実証した。その個体をfounderとしてF1及びF2を飼育し、GFPの発現が眼球特異的であることをウェスタンブロッティング及びGFP発光観察により確認し、さらに網膜の桿体視細胞特異的であることをGFP発光観察により立証した。さらにGFP発現誘導開始時期は桿体視物質遺伝子発現と同じ受精後48時間であり、開始場所は網膜腹側の同一箇所であることも確認した。これらから桿体視物質遺伝子のプロモーター領域が遺伝子上流4.2kb内にあることが明らかとなった。インジェクションをおこなった個体にみられた松果体での発現誘導はトランスジェニックラインでは観察されなかった。

研究表明，小鼠在同一视锥细胞中表达两种类型的视锥视觉物质，并且很明显小鼠不适合通过引入新的视觉物质基因来阐明增强色觉的机制。因此，我们决定将研究范围缩小到斑马鱼。我们使用绿色荧光蛋白（GFP）报告基因对斑马鱼视杆视觉物质基因进行启动子分析。对于视杆视觉物质基因，使用邻近的上游DNA区域4.2、2.5和1kb研究了诱导GFP表达的能力。将每个表达构建体显微注射到受精斑马鱼卵中，并在每个个体超过 50% 的视网膜中证实了 GFP 表达。此外，我们在 10-30% 的个体中观察到 GFP 在大脑（可能是松果体）中表达。引入 4.2 kb 上游构建体的大约 100 个个体中就有一个将表达构建体传递给下一代。这通过 F1 基因组 DNA 的 PCR 和 Southern 杂交得到证实。以此个体为基础，我们培育了F1和F2，并通过蛋白质印迹和GFP发光观察证实了GFP表达具有眼球特异性，并通过GFP发光观察进一步证实了其对视网膜中的杆状感光细胞具有特异性。 。此外，我们确认了GFP表达的诱导在受精后48小时开始，与视杆视神经物质基因表达的时间相同，并且诱导在视网膜腹侧的相同位置开始。这些结果表明视杆视觉物质基因的启动子区域位于该基因上游4.2kb以内。在注射个体中观察到的松果体表达的诱导，在转基因系中没有观察到。

项目成果

河村正二: "新世界サルRed-Green視物質遺伝子と色覚の進化"霊長類研究. 16. 111-124 (2000)

Shoji Kawamura：“新世界猴红绿色视觉物质基因和色觉的进化”灵长类动物研究。 16. 111-124 (2000)。