ショウジョウバエ培養細胞を用いた再構築概日系の確立

利用培养果蝇细胞重建昼夜节律系统的建立

基本信息

批准号：
11874123
负责人：
松本顕
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11874123/
关键词：
ショウジョウバエサーカディアンリズム培養細胞

项目摘要

per,timに対する正の転写因子であるCLKを強力な定常的発現プロモーターであるcytoplasmic actinプロモーターを使って(Act5C-clk)培養細胞内で発現させた。western blotによりPERおよびTIMの発現をモニターすると、TIMの発現は誘導されるが、PERの発現は誘導されなかった。そこで、Act5C-clkとともにper遺伝子のゲノム断片(G-per)をS2 cellにco-transfectした。その結果、TIMのみでなくPERの発現も観察された。次に28時間に渡って、TIMおよびPERの発現量の変動のモニターを試みたが、変動は観察されなかった。これは、正の転写因子であるCLKが恒常的に供給された結果であると解釈された。そこで、一過的な発現を誘導するheat shock protein 70のプロモーター下流にclk遺伝子を連結し(hs-clk)、37℃30分の熱ショックにより一過的にCLKを発現させて、その後のPERおよびTIMの発現をモニターした。hs-clkとG-perのco-transfectionを行うと、熱ショックを与えた場合にのみPERの強い発現が誘導された。熱ショックを与えた後、約5日間に渡って3-4時間ごとのサンプリングを行い、PERおよびTIMの発現量の変動のモニターを試みると、約26時間の周期性を持ったPER/TIM量の変動が観察された。振動は約4回繰り返された。再現性を確認するために、実験を繰り返した。実験毎に、周期、およびPER量のピーク位相にはズレが生ずるが、振動がほぼ一定周期で繰り返されること、数日後にはPER/TIMの発現が観察できないレベルにまで減衰することには再現性があり、培養細胞内での概日リズムの再構築に成功したと判断した。

CLK 是 per,tim 的正转录因子，使用细胞质肌动蛋白启动子 (Act5C-clk)（一种强恒定表达启动子）在培养细胞中表达。当通过蛋白质印迹监测PER和TIM的表达时，TIM表达被诱导，但PER表达未被诱导。因此，我们将pergene基因组片段（G-per）与Act5C-clk共转染至S2细胞中。结果，不仅观察到TIM表达，还观察到PER表达。接下来，我们尝试监测 28 小时内 TIM 和 PER 表达水平的变化，但没有观察到变化。这被解释为持续供应 CLK（一种正转录因子）的结果。因此，我们将clk基因（hs-clk）连接到热休克蛋白70的启动子下游，诱导瞬时表达，并通过37℃热休克30分钟瞬时表达CLK并监测TIM表达。当hs-clk和G-per共转染时，只有在施加热激时才诱导PER的强表达。进行热休克后，在约5天内每3至4小时进行一次采样，以监测PER和TIM的表达水平的变化。结果，检测到PER/TIM的量以约26小时的周期波动。被观察到。振动重复大约4次。重复该实验以确认再现性。虽然各个实验的 PER 量的周期和峰值相位存在差异，但可以重现的是，振荡以几乎恒定的周期重复，并且 PER/TIM 的表达在几天后衰减到不可观察的水平。结论是在培养细胞中成功重建了昼夜节律。