小胞体のイノシトール三リン酸結合部位の固定と再構成

内质网中肌醇三磷酸结合位点的固定和重建

基本信息

批准号：
61215023
负责人：
平田雅人
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Special Project Research
财政年份：
1986
资助国家：
日本
起止时间：
1986 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-61215023/
关键词：
イノシトール三リン酸光親和性標識小胞体【Ca^(2+)】遊離

项目摘要

細胞小胞体膜上に存在するイノシトール1,4,5-三リン酸(I【P_3】)の受容体を同定するため、I【P_3】の光感受性誘導体を合成し、サポニン処理マクロファージ(S-MФ)小胞体を用いて実行した。I【P_3】誘導体の調製法は基本的には既報のとおりカルボニルジイミダゾール(CDI)を用いて行なったが、光感受性基としてはアイソトープを導入するため既報のP-アジド安息香酸(pAB)に〔【^3H】〕β-アラニンをカップルしたもの(〔【^3H】〕アジド安息香酸β-アラニン、〔【^3H】〕ABβA)を用いた。このI【P_3】-〔【^3H】〕ABβAは25〜35cpm/pmolの放射比活性を有していた。S-MФとともに光照射した後、SDS電気泳動によりタンパクを分離したところ、80K,50K,30Kの三種類の分子量の付近がラベルされた。しかし、これはカットしたゲルをカウントして得られたもので、オートラジオグラフィーにより決定されたものではない。そこで、次に光感受性基としてアジドサリチル酸β-アラニン(ASβA)を用いた。ASβAはクロラミンTを用いて【^(125)I】を酸化的に導入できる。この様にして調製したI【P_3】-〔【^(125)I】〕ASβAは100〜200cpm/pmolの放射比活性を有していた。S-MФを光照射によりラベルして、SDS電気泳動およびオートラジオグラフィーを行なったところ、分子量80〜85K,50K,27Kの三種類のタンパク質が相対的に強くラベルされていた。これらのラベルは過剰のI【P_3】の共存下で弱くなっていた(I【P_2】は無効)。I【P_3】ホスファターゼを強く阻害する2,3-ジホスホグリセレイトの共存下でも同じく三種類のタンパク質がラベルされた。これらの結果から三種類のタンパク質がI【P_3】受容体であると考えられた。さらに確認するため、細胞成分分画を行ない、これらのラベルが小胞体分画に局在しているのか、また他の細胞でも同様にラベルされるのか等について、さらに検討している。

为了识别细胞内质网膜上肌醇1,4,5-三磷酸（I[P_3]）的受体，我们合成了I[P_3]的光敏衍生物，并使用皂苷处理的巨噬细胞（S - MФ）使用内质网进行。 I [P_3]该衍生物的制备方法基本上是使用之前报道的羰基二咪唑（CDI）进行的，但是由于引入了同位素作为光敏基团，使用与[[^3H]]β-丙氨酸（[[^3H]]叠氮基苯甲酸β-丙氨酸，[[^3H]]ABβA）偶联的对叠氮基苯甲酸（pAB）。该 I[P_3]-[[^3H]]ABβA 的特定放射性活性为 25-35 cpm/pmol。用S-MФ光照射后，通过SDS电泳分离蛋白质，标记分子量为80K、50K、30K的蛋白质。然而，这是通过计数切割凝胶获得的，而不是通过放射自显影确定的。因此，我们接下来使用叠氮水杨酸β-丙氨酸（ASβA）作为光敏基团。 ASβA 可以使用氯胺 T 氧化引入 [^(125)I]。以此方式制备的I[P_3]-[[^(125)I]]ASβA具有100-200 cpm/pmol的比放射性活度。当S-MФ经光照射标记并进行SDS电泳和放射自显影时，分子量为80-85K、50K和27K的三种类型的蛋白质被相对较强地标记。在存在过量 I[P_3] 的情况下，这些标签会被削弱（I[P_2] 无效）。 I [P_3] 三种类型的蛋白质在 2,3-二磷酸甘油酸存在下被类似地标记，2,3-二磷酸甘油酸强烈抑制磷酸酶。根据这些结果，三种类型的蛋白质被认为是 I [P_3] 受体。为了进一步证实这一点，我们正在进行细胞成分分级分离，以进一步检查这些标记是否位于内质网部分，以及其他细胞是否也有类似标记。