RNAをターゲットとしたHIV複製の阻害剤の遺伝的スクリーニング

HIV复制RNA靶向抑制剂的基因筛查

基本信息

批准号：
11161211
负责人：
原田和雄
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tokyo Gakugei University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は、これまでにRNA-タンパク質相互作用を細胞内で検出する系を開発し、HIVの複製において重要な役割を果すRev-response element(RRE)に結合する新規ペプチドをコンビナトリアル・ライブラリーから同定することができた。また、これらのペプチドがRREの結合相手であるRevタンパク質によるRNAの核外輸送を阻害することを明らかにした。このことから、特定のRNAを標的とするペプチドを用いることにより、HIV複製をさまざまなステップで制御できることが示唆された。しかし、このスクリーニング法を用いてRRE以外のRNA構造と結合するペプチドの同定を試みたが、成功に至っていない。そこで、多様なRNAと結合するペプチドの同定が可能となるよう、これまでに二つの改良を行ってきた。まず、上述の実験系を用いてより多くの配列を検索できるよう、レポーター遺伝子であるLacZの代りにカナマイシン耐性遺伝子(NPT II)を挿入した。その結果、RNAとポリペプチドの結合活性と対応するカナマイシン耐性が得られ、原理的には10^8〜10^9のペプチド配列からの「セレクション」が可能となったことを既に報告した。そこで、本研究期間は、このカナマイシン耐性遺伝子を用いたレポーター系を最適化するとともに、コンビナトリアル・ライブラリーのデザイン法の改良を行った。具体てきには、ポリアルギニンに高い割合いで変異を導入した形のライブラリーを作製し、RRE結合ペプチドをスクリーニングしたところ、高いRRE結合能を有するペプチドを容易に同定できた。現在、種々のHIV RNA構造を標的としたスクリーニングを行っている。また、既に同定したRRE結合ペプチド(RSG-1.2)がRevタンパクの阻害剤のリード化合物であると考え、in vivo RNA selection法によるRSG-1.2との結合において重要なRRE上のヌクレオチドを同定し、Revとの結合様式の違いを解析している。

我们开发了一种用于细胞内检测 RNA-蛋白质相互作用的系统，并从组合文库中鉴定出一种与 Rev 响应元件 (RRE) 结合的新型肽，该元件在 HIV 复制中发挥着重要作用。我们还发现这些肽通过 Rev 蛋白抑制 RNA 从细胞核输出，Rev 蛋白是 RRE 的结合伴侣。这表明可以通过使用针对特定 RNA 的肽在各个步骤中控制 HIV 复制。然而，使用这种筛选方法鉴定与 RRE 以外的 RNA 结构结合的肽的尝试尚未成功。因此，到目前为止，我们已经进行了两项改进，使得鉴定与多种RNA结合的肽成为可能。首先，插入卡那霉素抗性基因（NPT II）代替报告基因LacZ，以便可以使用上述实验系统搜索更多序列。结果，我们已经报道了获得了与RNA-多肽结合活性相对应的卡那霉素抗性，使得原则上从10^8到10^9肽序列中“选择”成为可能。因此，在本研究期间，我们利用该卡那霉素抗性基因优化了报告系统，并改进了组合文库设计方法。具体来说，他们创建了一个包含高比例引入聚精氨酸的突变的文库，并筛选了 RRE 结合肽，并且能够轻松识别具有高 RRE 结合能力的肽。目前，我们正在针对各种HIV RNA结构进行筛选。此外，考虑到先前鉴定的 RRE 结合肽 (RSG-1.2) 是 Rev 蛋白抑制剂的先导化合物，我们使用体内 RNA 选择方法鉴定了 RRE 上对于与 RSG-1.2 结合非常重要的核苷酸我们正在分析与Rev的绑定方式的区别。