RNAをターゲットとしたHIV複製の阻害剤の遺伝的スクリーニング

HIV复制RNA靶向抑制剂的基因筛查

基本信息

批准号：
11161211
负责人：
原田和雄
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tokyo Gakugei University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は、これまでにRNA-タンパク質相互作用を細胞内で検出する系を開発し、HIVの複製において重要な役割を果すRev-response element(RRE)に結合する新規ペプチドをコンビナトリアル・ライブラリーから同定することができた。また、これらのペプチドがRREの結合相手であるRevタンパク質によるRNAの核外輸送を阻害することを明らかにした。このことから、特定のRNAを標的とするペプチドを用いることにより、HIV複製をさまざまなステップで制御できることが示唆された。しかし、このスクリーニング法を用いてRRE以外のRNA構造と結合するペプチドの同定を試みたが、成功に至っていない。そこで、多様なRNAと結合するペプチドの同定が可能となるよう、これまでに二つの改良を行ってきた。まず、上述の実験系を用いてより多くの配列を検索できるよう、レポーター遺伝子であるLacZの代りにカナマイシン耐性遺伝子(NPT II)を挿入した。その結果、RNAとポリペプチドの結合活性と対応するカナマイシン耐性が得られ、原理的には10^8〜10^9のペプチド配列からの「セレクション」が可能となったことを既に報告した。そこで、本研究期間は、このカナマイシン耐性遺伝子を用いたレポーター系を最適化するとともに、コンビナトリアル・ライブラリーのデザイン法の改良を行った。具体てきには、ポリアルギニンに高い割合いで変異を導入した形のライブラリーを作製し、RRE結合ペプチドをスクリーニングしたところ、高いRRE結合能を有するペプチドを容易に同定できた。現在、種々のHIV RNA構造を標的としたスクリーニングを行っている。また、既に同定したRRE結合ペプチド(RSG-1.2)がRevタンパクの阻害剤のリード化合物であると考え、in vivo RNA selection法によるRSG-1.2との結合において重要なRRE上のヌクレオチドを同定し、Revとの結合様式の違いを解析している。

我们先前已经开发了系统来检测细胞中RNA-蛋白质相互作用的系统，并能够鉴定出与Rev-Response元素（RRE）结合的新型肽，这些肽（RRE）在HIV复制中起着来自组合文库的重要作用。我们还揭示了这些肽抑制了RRE的结合伴侣Rev蛋白RNA的核转运。这表明可以通过使用针对特定RNA的肽来控制HIV复制。但是，尝试使用这种筛选方法鉴定与RRE以外的RNA结构结合的肽的尝试尚未成功。因此，到目前为止，已经进行了两个改进，以鉴定与各种RNA结合的肽。首先，插入了卡纳米霉素抗性基因（NPT II）代替报告基因lacz，以便可以使用上述实验系统搜索更多序列。结果，获得了卡纳米霉素的抗性，与RNA和多肽的结合活性相对应，原则上，据报道，从10^8至10^9的肽序列中“选择”是可能的。因此，在这一研究期间，我们使用此Kanamycin耐药基因优化了报告基因系统，并改善了组合文库的设计方法。具体而言，准备了一个文库，其中引入了以高精氨酸速率引入突变，并筛选了RRE结合肽，以轻松识别具有高RRE结合能力的肽。目前，筛选针对各种HIV RNA结构。此外，先前鉴定的RRE结合肽（RSG-1.2）被认为是Rev蛋白抑制剂的铅化合物，RRE上的核苷酸对于通过体内RNA选择方法结合与RSG-1.2很重要，并且在与REV模式的结合模式下鉴定了差异。