新規アンチセンス核酸を用いるエイズウイルス遺伝子の発現制御

使用新型反义核酸控制艾滋病病毒基因表达

基本信息

批准号：
11161212
负责人：
和田猛
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11161212/
关键词：
アンチセンス核酸 DNAアナログ保護基 H-ホスホネートDNA エイズウイルス mRNA

项目摘要

現在、エイズウイルス遺伝子を標的としたアンチセンス法はある種の限界に到達しており、飛躍的な新しいアイディアの出現が待たれているのが現状である。我々はごく最近、アミノ基およびリン酸基に保護基を必要としない全く新しい核酸分子構築法を開発した。従来の核酸合成法では核酸のアミノ基およびリン酸基に塩基性条件下除去される保護基が用いられているために保護基の除去条件下で分解してしまうようなDNAの誘導体を得ることができなかった。我々の開発した新しい方法を用いればこれらの核酸誘導体が効率良く合成できるはずである。さらに、この新しい核酸合成法の特徴はリン酸よりも酸化度の低いH-ホスホネートDNA中間体を経由するために、この中間体からインターヌクレオチドを修飾した種々のアンチセンス核酸への変換が可能である。そこで、本研究では遊離のアミノ基をもつH-ホスホネートDNAを合成し、これを種々の新規アンチセンス核酸に変換する試みをおこなった。まず、すべての新規アンチセンス核酸合成における共通の合成中間体であり、構造的に最も単純なP-H結合をもつH-ホスホネートDNAの合成を検討した。オリゴヌクレオチドの3'および5'末端にヒドロキシヘキシル基を導入することによってインターヌクレオチド結合を安定化することができることを見出し、世界で初めてH-ホスホネートDNAを単離することに成功した。つぎに、このH-ホスホネートDNAを種々の新規アンチセンス核酸に変換する反応について検討したところ、P-NH_2結合をもつホスホロアミデートDNA、P-OCH_3結合をもつメチルホスフェートDNA、P-CH_2OH結合をもつヒドロキシメチルホスホネートDNAを合成することができた。一方、HIV-1 nef-mRNAの塩基配列を種々検索し、二次構造と変異頻度を考慮してアンチセンス核酸の標的部位を決定した。この標的部位に対する種々の新規アンチセンス核酸を合成し、nef-タンパク質の発現制御に関する基礎的な実験をおこなったが、顕著なアンチセンス活性は認められなかった。現在、種々の標的部位に対する鎖長の異なるアンチセンス核酸を用いて、nef-タンパク質の発現制御を試みている。

目前，针对艾滋病病毒基因的反义方法已经达到了一定的限度，我们正在等待激进的新想法的出现。我们最近开发了一种全新的方法来构建核酸分子，不需要氨基和磷酸基团的保护基团。常规的核酸合成方法中，在核酸的氨基和磷酸基上使用可在碱性条件下去除的保护基团，因此可以获得在去除保护基团的条件下降解的DNA衍生物。做不到。利用我们开发的新方法，我们应该能够有效地合成这些核酸衍生物。此外，这种新的核酸合成方法的一个特点是它使用H-膦酸DNA中间体，其氧化程度比磷酸低，因此可以将该中间体转化为用核苷酸间修饰的各种反义核酸。是。因此，在本研究中，我们合成了带有游离氨基的H-膦酸DNA，并尝试将其转化为各种新的反义核酸。首先，我们研究了 H-膦酸 DNA 的合成，它是所有新型反义核酸合成中常见的合成中间体，并且具有结构最简单的 P-H 键。我们发现，通过在寡核苷酸的3'端和5'端引入羟基己基可以稳定核苷酸间的键，并在世界上首次成功分离出H-膦酸DNA。接下来，我们研究了将该H-膦酸DNA转化为各种新反义核酸的反应，发现具有P-NH_2键的氨基磷酸酯DNA、具有P-OCH_3键和P-CH_2OH键的甲基磷酸酯DNA能够合成羟甲基膦酸。 DNA 与另一方面，我们搜索了HIV-1 nef-mRNA的各种碱基序列，并通过考虑二级结构和突变频率确定了反义核酸的靶位点。我们针对该靶位点合成了各种新的反义核酸，并进行了nef蛋白表达调控的基础实验，但没有观察到显着的反义活性。目前，我们正在尝试使用针对不同靶位点的不同链长的反义核酸来控制nef-蛋白的表达。