サイクリン依存性キナーゼ阻害分子p27の分解因子の同定及び解析

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂分子p27降解因子的鉴定及分析

基本信息

批准号：
11144228
负责人：
小南欽一郎
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11144228/
关键词：
酵母 p27 Rum1 タンパク分解ユビキチン SCF

项目摘要

CDK阻害分子p27の分解には、ユビキチン-プロテアソーム系の関与が示されているが、どのような分子がそのユビキチン化の特異性を決定するか明らかにされていない。そこで本研究では、p27/Rum1(酵母におけるP27の機能的ホモログ)の分解に関与する因子を取得する目的で、pop1変異株を含む酵母を用いた遺伝学的方法によりそれらの遺伝子群の同定を試みた。1.p27の分解因子の取得(1)p27をpop1+変異株中で高発現すると致死の表現型を示すことを見いだした。(2)酵母で発現するマウス胸腺由来のcDNAライブラリーを作成した。(3)p27高発現による致死性を抑圧する遺伝子を(2)のcDNAライブラリーより8クローン取得した。(4)これらには遺伝子発現の抑圧活性が無いことを確かめた。(5)これらには、ユビキチン遺伝子、60SリボソームL23遺伝子、さらに6つの未知の遺伝子が含まれていた。(6)現在、それらのp27に対するin vivoでの直接的影響を解析中である。2.Rum1分解に関わる変異株および阻害因子の取得(1)rum1+遺伝子とオーレオバシジン耐性遺伝子を融合させることにより、酵母内でのRum1タンパク質の安定性検出用モニターシステムを構築した。(2)上記遺伝子を発現している酵母細胞を変異源処理し、11株のRum1安定性に関わる変異株を取得した。(3)これらの変異株から現在までに6クローン取得し、トランスポゾンシステムにより対応する遺伝子を特定中である。(4)Rum1分解の阻害分子として、SUMO1に対するE2として知られているHus5、SCF複合体のSkp1に結合する分子Sgt1、その他未知の分子4つが取得された。(5)現在これらと、Rum1のユビキチン化に関わるSCF複合体との関係を、遺伝学的生化学的に検討中である。

泛素-蛋白酶体系统已被证明参与CDK抑制剂分子p27的降解，但尚不清楚是哪些分子决定其泛素化的特异性。因此，在本研究中，为了获得p27/Rum1（酵母中P27的功能同源物）降解所涉及的因子，我们尝试使用含有pop1突变体的酵母，通过遗传学方法来鉴定这些基因组。 1.获得p27的降解因子 (1)我们发现pop1+突变株中p27的高表达表现出致死表型。 (2)我们创建了在酵母中表达的小鼠胸腺衍生的cDNA文库。 (3)从(2)的cDNA文库中获得8个抑制p27高表达致死性的基因克隆。 (4)已证实它们不具有抑制基因表达的活性。 (5) 其中包括泛素基因、60S核糖体L23基因和六个未知基因。 (6) 我们目前正在分析它们对体内 p27 的直接影响。 2.获得Rum1降解相关的突变菌株和抑制因子(1)通过融合rum1+基因和aureobasidin抗性基因，构建了检测Rum1蛋白在酵母中稳定性的监测系统。 (2)用诱变剂处理表达上述基因的酵母细胞，获得11个与Rum1稳定性相关的突变株。 (3)迄今为止，我们已经从这些突变株中获得了6个克隆，目前正在利用转座子系统鉴定相应的基因。 (4) Hus5（SUMO1 的 E2）、Sgt1（与 SCF 复合物的 Skp1 结合）和其他四种未知分子作为 Rum1 降解的抑制剂。 (5)我们目前正在从遗传和生化的角度研究这些与参与Rum1泛素化的SCF复合体之间的关系。