ヒト癌細胞シスプラチン感受性決定因子としてのDNA損傷修復分子機構の解析

DNA损伤修复分子机制作为人类癌细胞顺铂敏感性决定因素的分析

• 批准号: 11140234
• 负责人: 高田 穣
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11140234/
• 关键词: DNA相同組換え; Rad51; ジーンターゲティング; ヌクレオチド除去修復

(1)Rad51ファミリーのニワトリ対応遣伝子をすべて単離しターゲティングコンストラクトを作成してジーンターゲティングを行い、5種類のRad51ファミリーすべてのミュータント細胞株を樹立した。これらの細胞株は以下の諸点においてほぼ同一の表現型を示した。すなわち、増殖の著明な緩徐化、死細胞の増加、染色体断裂の増加、ジーンターゲティング効率の極度の低下、sister chromatid exchange(SCE)出現頻度の低下、シス・MMCなどクロスリンカーに対する高感受性、ガンマ線に軽度感受生などである。ヒト・マウスの対応遺伝子の導入によって、調べ得た範囲で少なくともγ線・シスの感受性や死細胞数増加などの表現型が抑制された。したがって、Rad51ファミリーの各遺伝子は高等真核生物のHR分子機構に必須であり、染色体安定性やDNAクロスリンク修復において重要と考えられる。興味深いことにシスやγ線に対する感受性はヒトRad51を強制発現させることで部分的ではあるが正常化した。(2)DT40のミュータント細胞においてRad51ファミリーのおのおののヒトあるいはマウスのcDNAを導入すると、野生型のDT40よりシスに対してより耐性になるという現象が見られた。そこでヒト肺ガン細胞株SBC3にヒトRad51BやRad51Cの強制発現を試みた。タグ付きのコンストラクトをトランスフェクトしウェスタンを行ったが、明瞭な発現を示すクローンを得ることができなかった。このファミリーの遺伝子が強発現すると細胞死が誘導される可能性がある。(3)シス処理等によるDNAダメージ後核内には抗Rad51抗体で明瞭に検出されるフォーカスが形成される。NERに必須なERCC1分子とXPA分子はそれぞれヒト患者から樹立された欠損細胞株があるが、特に前者でインターストランドクロスリンクに感受性が高いとされている。ERCC1はDNA損傷の5'側にニックを入れるエンドヌクレアーゼを構成するサブユニットであり、出芽酵母の対応するタンパクはある種のHRに関与することが知られている。そこでこれらの欠損細胞株でシス処理後のRad51フォーカス形成をアッセイしたが、フォーカスは特に問題なく形成された。(4)上記Rad51ファミリーのミュータント細胞におけるRad51フォーカス形成をMMC、γ線による処理後にアッセイした。各ミュータント細胞においては野生型とは異なり、フォーカスの大きさ輝度とも極度に低下して明瞭なフォーカス形成が消失していると考えられた。(5)HRとNERのダブルノックアウト株作成のため、ニワトリのERCC1とXPAの単離を試みた。XPAはすでにcDNA配列が報告されており、ゲノムDNAの分離も容易であったが、ERCC1はcDNAはとれたもののゲノムの単離に難渋している。ライブラリースクリーニングを行う予定である。XPAは現在ターゲティングコンストラクトを作成し、トランスフェクションを行っている。

(1)我们分离了Rad51家族的所有鸡相容基因，创建了靶向构建体，进行了基因靶向，并建立了所有五个Rad51家族成员的突变细胞系。这些细胞系在以下方面表现出几乎相同的表型。即增殖明显减慢、死细胞增加、染色体断裂增加、基因靶向效率极度下降、姐妹染色单体交换（SCE）频率降低、对顺式/MMC和γ等交联剂高度敏感部分患者对射线有轻度敏感。通过引入相应的人类和小鼠基因，至少将诸如γ射线和顺式敏感性以及死细胞数量增加等表型抑制到可以研究的程度。因此，Rad51家族的每个基因对于高等真核生物中的HR分子机制至关重要，并且被认为对于染色体稳定性和DNA交联修复具有重要意义。有趣的是，人类 Rad51 的强制表达使对顺式和 γ 射线的敏感性部分正常化。 (2)当将Rad51家族成员的人或小鼠cDNA导入DT40突变细胞时，观察到细胞比野生型DT40对顺式具有更强的抵抗力。因此，我们尝试在人肺癌细胞系SBC3中强制表达人Rad51B和Rad51C。尽管转染了标记的构建体并进行了Western分析，但没有获得显示清晰表达的克隆。该家族基因的强烈表达可能会诱导细胞死亡。 (3)经顺式处理造成DNA损伤后，细胞核内形成可用抗Rad51抗体清晰检测到的病灶。 ERCC1 分子和 XPA 分子对于 NER 至关重要，它们都具有从人类患者中建立的有缺陷的细胞系，据说前者对链间交联特别敏感。 ERCC1 是核酸内切酶的一个亚基，可在 DNA 损伤的 5' 侧产生切口，已知酿酒酵母中的相应蛋白参与某些类型的 HR。因此，我们使用这些缺陷细胞系测定了顺式处理后Rad51病灶的形成，并且病灶的形成没有任何特殊问题。 (4)在用MMC和γ射线处理后测定上述Rad51家族突变细胞中Rad51焦点的形成。在每个突变细胞中，与野生型不同，焦点尺寸和亮度都极大减小，并且清晰的焦点形成被认为已经消失。 (5)为了创建HR和NER的双敲除菌株，我们尝试分离鸡ERCC1和XPA。 XPA的cDNA序列已经报道，分离基因组DNA很容易，但是虽然获得了ERCC1的cDNA，但分离基因组一直很困难。计划进行图书馆筛选。 XPA 目前正在创建靶向构建体并进行转染。

项目成果

Sonoda E., Sasaki M. S., Morrison C., Yamaguchi-Imai Y., Takata M., Takeda S.: "Sister chromatid exchanges are mediated by homologous recombination in vertebrate cells"Mol Cell Biol. 19. 5166-5169 (1999)

Sonoda E.、Sasaki M.S.、Morrison C.、Yamaguchi-Imai Y.、Takata M.、Takeda S.：“姐妹染色单体交换是由脊椎动物细胞中的同源重组介导的”Mol Cell Biol。

Morrison C., Shinohara A., Sonoda E., Yamaguchi-Imai Y., Takata M., Weichselbaum RR., Takeda S.: "The Essential functions of human Rad51 are independent of ATP hydrolysis"Mol Cell Biol. 19. 6891-6897 (1999)

Morrison C.、Shinohara A.、Sonoda E.、Yamaguchi-Imai Y.、Takata M.、Weichselbaum RR.、Takeda S.：“人 Rad51 的基本功能独立于 ATP 水解”Mol Cell Biol。