肺線維症進展過程における細胞形質変化機序の遺伝子レベルでの解明―α平滑筋アクチンプロモータトランスジェニックマウスを用いた検討―

从基因水平阐明肺纤维化进展过程中的细胞转化机制 - 使用α-平滑肌肌动蛋白启动子转基因小鼠的研究 -

• 批准号: 10877098
• 负责人: 守山 敏樹
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Osaka University (1999)Hyogo Medical University (1998)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10877098/
• 关键词: CArG; ゲルシフトアッセイ; one hybrid system; SRF; 転写因子; intron; 肺線維症; α-平滑筋アクチン; heat shock protein 47

昨年度に我々は、ヒトSMαA遺伝子5'上流-891bpおよびintron 1すべてを含む系統(891int-CAT)に加え5'上流-1231bpおよびintron 1を含むもの(123int-CAT)、また891int-CATからintron 1中の約3.3kb(891intΔBH-CAT)、および137bp(891intΔ0-CAT)を欠失させた合計4系統のトランスジェニックマウスを製作した。これらのマウスにおけるCAT発現を解析したところ平滑筋特異的発現および腎糸球体病変におけるSMαA遺伝子発現には intron1の配列、特にCArG#0 motif 周辺の配列が必須であることが明らかになった。この結果をふまえて、このうち891int-CAT および891intΔ0-CATに対してブレオマイシン投与を行い線維化病変を作製したところ、前者のみにSMαA発現部位に一致してCAT発現を認めた。この結果は腎糸球体病変でのSMαA発現に必須であることが明らかとなったCArG#0 motif 周辺の配列が肺線維化病変でのSMαAの発現にも必須の役割を果たすことを示している。今年度は同部位に結合する転写調節因子を同定するためにCArG#0 motif 周辺をプローブとしてゲルシフトアッセイを行った。その結果、2本のシフトバンドを認めそのうちの1本はc-fos遺伝子のSREであるCArG配列で競合阻害を受けること、そして杭SRF抗体添加によりスーパーシフトすることから、このバンドがSRF-CArG複合体であることが明らかとなった。現在、もう1本のバンドを形成するDNA結合蛋白質を同定する目的で酵母one hybrid systemによるcDNAクローニングを進めている。今のところ5種類のDNA結合蛋白質のcDNAクローンが得られている。現在これらの遺伝子産物の線維化病変における発現変化の解析を進めるとともに、培養細胞を用いて発現レベルを強制的に変化をさせた際の細胞形質変化の検討を開始している。以上から、肺線維化病変の分子病態が明らかとなり、さらに新たな治療戦略への道が開けることが期待される。

去年，我们将包括一个包含一个包含所有人类SMαA基因5'上游-891bp和内含子1（891 int -cat），5'上部-1231bp和内含子1（123 int -cat）的系统（891 int -cat）和总共产生了891个INT猫。对这些小鼠中CAT表达的分析表明，肾球形病变中SMαA基因的表达和SMαA基因的表达，尤其是CARG＃0基序周围的阵列中的表达是必不可少的。基于此结果，对891个INT-CATS和891INTΔ0-CATS进行了半霉素的给药，以产生纤维损伤。结果表明，Carg＃0基序的阵列已经表明，SMαA在肾球状病变中的表达至关重要，在SMαA表达中也起着至关重要的作用。今年，对CARG＃0基序探测进行了凝胶化测定，以识别与同一位点结合的转移调整因子。结果，识别了两个换档带，其中一个是在C-Fos Gene SRE中接收竞争，并添加了桩SRF抗体，因此该频段是SRF-Carg。这是一个复杂的。当前，通过酵母菌的cDNA克隆正在促进，以鉴定形成另一个条带的DNA结合蛋白。目前，已经获得了五种类型的DNA结合蛋白cDNA克隆。当前，正在分析这些基因产物纤维病变中表达变化的分析，当使用培养细胞强行改变表达水平时细胞性状的变化。从以上，预计将揭示肺纤维病变的分子病理，并预计将打开新治疗策略的途径。