免疫学的手法によるNaチャンネルの分子およびその機能の解析

利用免疫学方法分析Na通道分子及其功能

基本信息

批准号：
60215003
负责人：
中山仁
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Special Project Research
财政年份：
1985
资助国家：
日本
起止时间：
1985 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度我々が達成した電気ウナギNaチャンネルの全一次構造決定をはじめとして、Naチャンネルを分子レベルで記述しようとする研究は最近大きく展開されつつあるが、新たに解決を要す問題点も浮きぼりにされてきた。例えば動物種によるチャンネルサブユニット構成の違いと機能発現との関連を探ることを目的に、本研究では(1)未だ達成されていないラット脳の本チャンネルに対するモノクローナル抗体の作成と、(2)電気ウナギチャンネル全一次構造上の特定のアミノ酸配列に対するmono-specific抗体の作成を行い、若干の性質を調べた。(1)モノクローナル抗体の作成:ラット脳から精製したNaチャンネルタンパクを抗原としてマウスに免疫し、ミエローマ細胞と常法通りに融合してハイブリドーマを得た。ELISA法でスクリーニングし、2回の限界希釈法により精製チャンネルタンパクと反応する3種のクローンを確立した。このうち最も抗体活性の高いクローン3GIを用い、その抗体の性質を調べたところ、ラット脳Naチャンネルの〜25OKポリペプチドと結合するが、S-S結合を還元したチャンネルとは結合しなくなることから、高次構造を認識した抗体と考えられる。またこの抗体は電気ウナギのチャンネルとは交叉反応しないことから、両者を識別する目的に役立つ。(2)mono-specific抗体の作成:電気ウナギチャンネルのアミノ酸配列の中から、N末端部、C末端部、ゲート機構を構成すると推定される配列、特異的トキシン結合推定部位などを含む10〜15アミノ酸から成るペプチドを合成し、これをハプテンとしてウサギに免疫した。7種の合成ペプチドのうち、現在までに5種については抗体力価も満足すべき抗血清が得られた。これらの抗血清を用い、チャンネルトポロジーの解析等への応用が期待される。

近年来，在分子水平上描述Na通道的研究取得了很大进展，包括我们去年完成的电鳗Na通道整个一级结构的测定，但也出现了需要解决的新问题。它一直。例如，为了探索不同动物物种的通道亚基组成差异和功能表达之间的关系，本研究的目的是（1）在大鼠大脑中创建针对该通道的单克隆抗体，而该抗体尚未实现， (2)我们针对鳗鱼通道整个一级结构上的特定氨基酸序列创建了单特异性抗体，并研究了其一些特性。 (1)单克隆抗体的制备：以大鼠脑中纯化的Na通道蛋白为抗原免疫小鼠，按常规方法与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤。通过ELISA筛选和两轮有限稀释，建立了三个与纯化的通道蛋白反应的克隆。当我们使用其中抗体活性最高的克隆3GI研究抗体的特性时，我们发现它与大鼠脑Na通道的~25OK多肽结合，但不与S-S键还原的通道结合，因此发现其具有高抗体活性，认为该抗体识别以下结构。该抗体也不与电鳗通道发生交叉反应，因此可用于区分两者。 (2)单特异性抗体的创建：从电鳗通道的氨基酸序列中选择10至15个氨基酸，包括N端、C端、推测构成门机制的序列、特异性毒素结合位点、我们合成了一种由氨基酸组成的肽，并用它作为半抗原来免疫兔子。在这7种合成肽中，目前已经获得了其中5种具有令人满意的抗体效价的抗血清。这些抗血清预计将用于分析通道拓扑。