RNAをターゲットとしたHIV複製の阻害剤の遺伝的スクリーニング

HIV复制RNA靶向抑制剂的基因筛查

基本信息

批准号：
10180208
负责人：
原田和雄
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Tokyo Gakugei University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々はこれまでにRNA-タンパク質相互作用を細胞内で検出する系を開発した。この系を用いて、HIVの複製において重要な役割を果すRev-response element(RRE)に結合する新規ペプチドをコンビナトリアル・ライブラリーから遺伝的に同定することができた。さらに、これらのペプチドがRREの結合相手であるRevタンパク質による、RREを持つRNAの核外輸送を阻害することを明らかにした。このことから、特定のRNAを標的とするペプチドを用いることにより、HIV複製をさまざまなステップで制御できることが示唆された。しかし、現在のところ、このスクリーニング法を用いてRREと結合するペプチドの同定にしか成功していない。本研究期間は、多様なRNAと結合するペプチドの同定が可能となるよう、ふたつの改良を行ってきた。まず、上述の実験系を用いてより多くの配列が検索できるよう、レポーター遺伝子であるLacZの代りにカナマイシン耐性遺伝子(NPTII)を挿入した。種々のRNAとポリペプチドを用いた実験の結果、LacZレポーターで見られた活性と対応するカナマイシン耐性が得られた。これによって、原理的には10^8〜10^9の配列からの「セレクション」が可能となった。次に、ライブラリーのデザイン法の改良を行った。アルギニンを豊富に含むペプチドがRNAとの特異的な結合に優れている点に注目して、ポリアルギニンに高い割合いで変異を導入したライブラリーを作製した。現在、このライブラリーの質をテストする意味で、まずRRE結合ペプチドのスクリーニングをはじめている。

我们之前开发了一种用于检测细胞内 RNA-蛋白质相互作用的系统。使用该系统，我们能够从组合文库中遗传鉴定出一种与 Rev 响应元件 (RRE) 结合的新型肽，该元件在 HIV 复制中发挥着重要作用。此外，他们还发现这些肽通过 Rev 蛋白抑制 RRE 携带 RNA 的核输出，Rev 蛋白是 RRE 的结合伴侣。这表明可以通过使用针对特定 RNA 的肽在各个步骤中控制 HIV 复制。然而，迄今为止，使用这种筛选方法仅成功鉴定了与 RRE 结合的肽。在此研究期间，我们进行了两项改进，以能够识别与多种 RNA 结合的肽。首先，插入卡那霉素抗性基因（NPTII）代替报告基因LacZ，以便使用上述实验系统可以搜索更多序列。使用各种 RNA 和多肽进行的实验产生了卡那霉素抗性，这与 LacZ 报告基因所观察到的活性相对应。原则上，这使得从 10^8 到 10^9 数组中“选择”成为可能。接下来，我们改进了库的设计方法。着眼于富含精氨酸的肽与RNA具有优异的特异性结合这一事实，他们创建了一个库，其中将高比例的突变引入到聚精氨酸中。目前，为了测试该库的质量，我们首先筛选RRE结合肽。