カルシウム感受性のあるミオシン分子のモータードメインの機能的発現の試み

尝试功能性表达钙敏感肌球蛋白分子的运动结构域

基本信息

批准号：
10175204
负责人：
小浜一弘
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10175204/
关键词：
ミオシンカルシウム結合モータードメイン発現蛋白質粘菌

项目摘要

本研究はCa^<2+>結合性があるフィザルム・ミオシン重鎖の「モータードメイン」(「制御ドメイン」を含む)を組換体発現蛋白質として得て、軽鎖を組込ませS1を再構成しようとするものである。1)「制御ドメイン」はCa^<2+>結合性を有する(但し、Ca^<2+>の作用は逆である)ホタテ貝ミオシンの成功例にならい、私どもは大腸菌で発現させることに成功した。軽鎖を組込んだ上で結晶化を試み、重原子置換→X線回折により高分解能で立体構造を決定できる途が開く。結晶化はCa^<2+>存在下で行なわれるので、ホタテ貝では「on」の状態で結晶化されている。フィザルムでは「off」の情報を与えることになり、必須軽鎖のGly117近傍の変化に注目する。2)「モータードメイン」をメチロトローフ酵母の系を用い分泌蛋白として大量に得る。軽鎖を組込んだ上、Motility assayにより機能を検定する。特に、ホタテ貝ミオシン軽鎖とのhybridによるCa^<2+>の作用の変化を検出する点に重点をおく。本研究はこの様な内容を実施するものであるが、本年度の成果を以下に示す。A. フィザルム・ミオシンの「制御ドメイン」をコードするcDNAクローニング 1)フィザルム変形体より精製したミオシンの重鎖をトリプシンにより限定分解した。70/60K、28K、17Kの各々のドメインよりアミノ酸部分配列を決定した。次に、粘菌フィザルムよりのmRNAを得て、このfirst strand cDNAを鋳型に、部分アミノ酸配列から推定される塩基配列をプローブにRT・PCRにより、望む部位のDNAを増幅した。2)TAクローニングキット(lnvitrogen 社)によりPCR産物のクローンを得て、塩基配列を決定した。B. 「制御ドメイン」の大腸菌内の発現 1)Aで得られたcDNAのうち、28KドメインのcDNAをPCR法により増幅した。2)近年開発された強力なT7プロモーターを有するプラスミド:pET21に組み込み、これを大腸菌内(BL21株)に発現させた。3)大量培養のうち、蛋白質化学的手法で精製した。C. 「制御ドメイン」のCa^<2+>結合測定並びに結晶化の試み1)Bの方法に準じて、すでにフィザルム・ミオシンの必須軽鎖及び制御軽鎖が機能あるかたちで得られているが、「制御ドメイン」とこれら軽鎖を結合させる。流動透析法にてCa^<2+>結合を測定したところ、良いCa結合値が得られた。

在本研究中，我们获得了泡浆肌球蛋白重链的“运动结构域”（包括“调节结构域”），其具有Ca^<2+>结合特性，作为重组表达蛋白，掺入了轻链，并重构S1，这就是我正在尝试做的。 1）“调节域”具有Ca^<2+>结合特性（然而，Ca^<2+>的作用是相反的），继扇贝肌球蛋白的成功例子之后，我们在大肠杆菌中成功表达了它。。结合轻链后尝试结晶，为通过重原子取代和 X 射线衍射确定高分辨率的三维结构打开了大门。结晶在Ca 2+ 存在下发生，因此在扇贝中它在“on”状态下结晶。 Physalum 将提供“关闭”信息，我们将重点关注必需轻链 Gly117 附近的变化。 2)使用甲基营养酵母系统获得大量的“运动结构域”作为分泌蛋白。掺入轻链后，通过运动性测定来测定其功能。特别地，我们将重点检测由于与扇贝肌球蛋白轻链杂交而引起的Ca ^ 2+ 作用的变化。本研究的内容如上所述，今年的结果如下所示。 A.编码泡浆肌球蛋白“调节结构域”的cDNA的克隆1)用胰蛋白酶对从泡浆变体纯化的肌球蛋白重链进行有限消化。从每个 70/60K、28K 和 17K 结构域确定氨基酸部分序列。接下来，从粘菌绒泡菌中获取mRNA，以该第一链cDNA为模板，以由部分氨基酸序列推导的碱基序列为探针，通过RT/PCR扩增所需位点的DNA。 2)使用TA克隆试剂盒(Invitrogen)获得PCR产物的克隆，并确定核苷酸序列。 B.“调节结构域”在大肠杆菌中的表达1)在A中获得的cDNA中，通过PCR扩增28K结构域cDNA。 2)将其整合到最近开发的具有强T7启动子的质粒pET21中，并在大肠杆菌(BL21菌株)中表达。 3）大量培养的产品中，采用蛋白质化学方法进行纯化。 C.尝试测量“调节结构域”的Ca 2+ 结合和结晶1)已经根据方法B以功能形式获得了泡浆肌球蛋白的必需轻链和调节轻链。将这些轻链与“监管领域。”当使用液体透析测量Ca^<2+>结合时，获得了良好的Ca结合值。