ミオシン軽鎖キナーゼにより調節される細胞内Ca^<2+>流入機構の分子生物学的検討

肌球蛋白轻链激酶调控细胞内Ca^2+内流机制的分子生物学研究

• 批准号: 10169223
• 负责人: 渡邊 裕司
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Hamamatsu University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10169223/
• 关键词: カルシウムイオン; ミオシン軽鎖キナーゼ; マクロファージ

【目的】非興奮性細胞において細胞内Ca^<2+>ストアにより調節される容量依存性Ca^<2+>流入機構が存在するがそのメカニズムは明らかではない。本研究では、ヒトマクロファージの容量依存性Ca^<2+>流入機構におけるミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)の役割について検討した。【方法】Ficoll-Paqueを用い遠心分離したヒトマクロファージを用いた。細胞内Ca^<2+>濃度の変化はfura-2/AMを負荷後340/380nmの励起波長による蛍光強度比より評価した。ミオシン軽鎖(MLC)リン酸化は、Stullの方法に準じUrea Gel Electrophoresisを用いたWestern Blottingにより定量化した。【結果】(1)小胞体Ca^<2+>-ATPaseの阻害剤であるthapsigargin(TG:lμM)およびcyclopiazonic acid(CPA:100μM)投与により細胞内Ca^<2+>濃度は1μM以上の持続的な上昇を認めた。細胞外Ca^<2+>非存在下では、TGおよびCPA投与にて一過性の軽度な上昇を認めたが持続的な上昇は認められなかった。(2)MLCK阻害剤であるML-9(100μM)およびwortmannin(100μM)は、TGおよびCPA刺激時の細胞外からのCa^<2+>流入をほぼ完全に抑制したが、細胞内貯蔵部位からのCa^<2+>動員には影響を及ぼさなかった。(3)TG投与によりMLCリン酸化が促進したが、ML-9およびwortmanninはこのリン酸化をほぼ完全に抑制した。【総括】ヒトマクロファージにおいても血管内皮細胞と同様にMLCKにより調節される容量依存性Ca^<2+>流入機構が存在した。非興奮性細胞における容量依存性Ca^<2+>流入調節にMLCKが中心的な役割をはたすことが示唆された。

[目的]非兴奋细胞中存在一种受细胞内Ca^2+储存调节的体积依赖性Ca^2+内流机制，但其机制尚不清楚。在本研究中，我们研究了肌球蛋白轻链激酶(MLCK)在人巨噬细胞体积依赖性Ca^2+流入机制中的作用。 [方法] 使用Ficoll-Paque离心的人巨噬细胞。根据负载fura-2/AM后在340/380nm激发波长下的荧光强度比评价细胞内Ca 2+ 浓度的变化。根据 Stull 的方法，使用尿素凝胶电泳通过蛋白质印迹法对肌球蛋白轻链 (MLC) 磷酸化进行定量。 [结果] (1)给予内质网Ca 2+ -ATP酶抑制剂毒胡萝卜素(TG：1μM)和环吡阿尼酸(CPA：100μM)使细胞内Ca 2+ 浓度增加至1μM以上。观察到持续增加。在不存在细胞外Ca 2+ 的情况下，使用TG和CPA施用观察到轻微的短暂增加，但没有观察到持续的增加。 (2) MLCK抑制剂ML-9(100μM)和渥曼青霉素(100μM)几乎完全抑制TG和CPA刺激后Ca^<2+>从细胞外流入，但对Ca^<2+>没有影响动员来自。 (3)TG给药促进MLC磷酸化，但ML-9和渥曼青霉素几乎完全抑制这种磷酸化。 [摘要]人巨噬细胞和血管内皮细胞中均存在MLCK调节的体积依赖性Ca^2+内流机制。这些结果表明MLCK在调节非兴奋性细胞中体积依赖性Ca 2+ 流入中发挥核心作用。