マウス始原生殖細胞における遺伝子発現の解析

小鼠原始生殖细胞基因表达分析

基本信息

批准号：
10160215
负责人：
阿部訓也
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は生殖系列分岐の鍵となる始原生殖細胞(PGC)に着目し,この細胞に発現する遺伝子の体系だった解析を行うことを目的とし研究を開始した.PGCは初期胚にごく少数、それも体細胞にかこまれたかたちで存在するため、研究材科として直接取り扱うことが困難であった.そこで、PGCのマーカーであるアルカリフォスファターゼ遺伝子をlacZ遺伝子で置換したTNAP(組織非特異型アルカリフォスファターゼ)ノックアウトマウスを用い、lacZレポーター発現を指標としてPGCを分離、純化するFACS-gal法を確立した.10.5日-14.5日胚がらPGCを実際にソーティングし、各種マーカーを用いた検索によりほぼ100%に近い純度のPGCが得られたことを確かめた.さらに,より初期のPGC単離のために,Oct3/4プロモーターにGFPをつないだコンストラクトを用いて,トランスジェニックマウスを作製し,これらのトランスジェニック系統の胚体から,より効率良くPGCを単離してくることが可能になった.この純化PGCを用い、テロメレース活性測定やゲノムDNAメチル化様式などの解析が可能になった.また,これを材料に、ローンリンカー法(Mamma1ian Genome2;252-259、1992)によりcDNAライブラリー作製を行った.この純化PGCからのcDNAは既知遺伝子のPGCでの発現解析のみならず、PGCにおける遺伝子発現プロファイルを解析、記述するために有用である.その解析の一端としてこれまで13.5日胚の雌難のPGCそれぞれのライブラリーから4000クローンをピックアップし、2800クローンの配列決定を行なった.このうち有効な配列情報の得られた1555クローンに関してホモロジー検索を行った.その多くはESTクローンを含め既知の遺伝子と相同性を示した.また雌雄で出現頻度に差異のあるクローンも複数認められた.将来的には,PGC各発生段階からライブラリーを作製,解析することにより興味深い配列モチーフを持つクローンやステージ特異的発現を示すクローンを単離し,機能解析につなげていきたいと考えている.また,始原生殖細胞の属性を遺伝子発現レベルで理解していくために,cDNA microarrayを用いた網羅的発現解析を計画している.

我们的研究重点是原始生殖细胞（PGC），这是种系分化的关键，并开始了我们的研究，目的是对这些细胞中表达的基因进行系统分析，因为它们存在于体细胞周围，所以这是很困难的。直接将它们作为研究材料处理。在这里，我们建立了一种 FACS-gal 方法，以 lacZ 报告基因表达为指标，使用 TNAP（组织非特异性碱性磷酸酶）敲除小鼠，其中碱性磷酸酶基因（PGC 标记）被 lacZ 取代。 .10.5th-我们实际上从 14.5 天的胚胎中分选 PGC，并使用各种标记进行搜索，并确认获得了纯度接近 100% 的 PGC。使用 GFP 连接到启动子的构建体，我们可以创建转基因克隆。现在，通过生产小鼠，可以更有效地从这些转基因系的胚胎中分离 PGC。使用这些纯化的 PGC，我们已经能够测量端粒酶活性并分析基因组 DNA 甲基化模式。此外，使用这种材料，贷款。连接器方法（Mamma1ian使用 Genome2 制备 cDNA 文库；252-259, 1992)。来自纯化的 PGC 的 cDNA 不仅用于分析 PGC 中已知基因的表达，还用于分析和描述 PGC 中的基因表达谱。作为该分析的一部分，我们迄今为止已从具有 13.5 天胚胎的 PGC 文库中挑选了 4,000 个克隆，并对 1555 个 2,800 个克隆进行了测序。我们对这些克隆进行了同源性搜索，其中许多克隆与已知基因（包括 EST 克隆）具有同源性。通过构建和分析原始生殖细胞的文库，我们还发现了多个在男性和女性之间出现频率不同的克隆。分离具有有趣序列基序的克隆和表现出阶段特异性表达的克隆，并将其与 cDNA 功能分析联系起来。我们正在计划使用微阵列进行全面的表达分析。