サイクリン分解の分子機構の解析

细胞周期蛋白降解的分子机制分析

• 批准号: 10160210
• 负责人: 徳元 俊伸
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Shizuoka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10160210/
• 关键词: サイクリン; プロテアソーム; タンパク質分解; CDNAクローニング

サイクリンBの分解は受精直後の卵に見られるばかりでなく、体細胞分裂における分裂期から間期への移行時に普遍的に見られると考えられる。各種変異サイクリンを用いた実験からサイクリンの分解は細胞分裂に必須であることが明らかにされているが、その分解機構に関しては不明な点が多い。申請者は、精製26SプロテアソームがサイクリンBのN末端を限定分解するという結果を得ている。そこで、卵成熟、つまり減数分裂期に重要なプロテアーゼとしてプロテアソームに焦点を絞り、分裂期に必須なサイクリンBのプロテアソームによる分解機構を解明することを目的として研究を進めてきた。これまでにリコンビナントサイクリンBを用いた実験から、26Sプロテアソームがサイクリンの限定分解を介してMPFの不活性化を行なうことを確証した。次にプロテアソームによる限定分解後から完全分解に至る過程がユビキチン系を介するものであるかどうか、卵内のユビキチン化酵素を精製し、サイクリンB分解中間体のユビキチン化を調べることで明らかにする。そこで、まずサイクリンBのユビキチン化部位と想定されているリジンリッチ領域内の6箇所のりジン残基の点突然変異体を作製した。一方、分解に必須であることが示されているサイクリンBのディストラクションボックスの点突然変異体も作製した。これら8種類の点突然変異体を用いた分解実験によりディストラクションボックスは26Sプロテアソームの認識配列にになっていること、N末端から61番目のリジン残基がユビキチン化部位である可能性が高いことが明らかになった。さらに、ユビキチン化酵素の一つであるE2-CのcDNAクローニングにも成功し、他のユビキチン化酵素群の同定も進めている。今後は精製26Sプロテアソームとユビキチン化酵素群を組み合わせた再構成系を構築し、サイクリン分解の分子メカニズムの全体像を明らかにする。

细胞周期蛋白 B 的降解不仅在受精后立即在卵子中观察到，而且似乎在体细胞分裂期间从有丝分裂到间期的过渡过程中普遍观察到。使用各种突变细胞周期蛋白的实验表明，细胞周期蛋白降解对于细胞分裂至关重要，但细胞周期蛋白降解的机制仍不清楚。申请人得到了纯化的26S蛋白酶体有限地降解cyclin B的N端的结果。因此，我们将蛋白酶体作为卵母细胞成熟即减数分裂期中重要的蛋白酶，以阐明蛋白酶体降解细胞周期蛋白B（细胞周期蛋白B在减数分裂期至关重要）的机制为目的进行了研究。有丝分裂期。之前使用重组细胞周期蛋白 B 进行的实验已证实 26S 蛋白酶体通过有限的细胞周期蛋白降解来灭活 MPF。接下来，我们将通过纯化鸡蛋中的泛素化酶并检测cyclin B降解中间体的泛素化情况来阐明从蛋白酶体有限降解到完全降解的过程是否是由泛素系统介导的。因此，我们首先在细胞周期蛋白B富含赖氨酸的区域中创建了六个赖氨酸残基的点突变体，该区域被认为是泛素化位点。另一方面，我们还创建了细胞周期蛋白 B 分散盒的点突变体，这已被证明对于降解至关重要。使用这八个点突变体的降解实验表明，牵引盒是26S蛋白酶体的识别序列，并且N末端的第61个赖氨酸残基很可能是泛素化位点。此外，我们成功克隆了泛素化酶之一E2-C的cDNA，并正在着手鉴定其他泛素化酶。未来，我们将构建一个结合纯化的26S蛋白酶体和泛素化酶的重构系统，以阐明细胞周期蛋白降解的整体分子机制。

项目成果

Toshinobu Tokumoto: "Disappearance of a novel protem component of the 265 proteasome during Xenopus oocyce maturation" Experimental Cell Research. (in press).

Toshinobu Tokumoto：“非洲爪蟾卵母细胞成熟过程中 265 蛋白酶体的新型蛋白质成分消失”实验细胞研究。

Motoki Toyama: "Characterization of active proteasome (265 proteasome) involved in Bufo japonicus oocyce maturation" Biomedical Research. 19・4. 253-260 (1998)

Motoki Toyama：“参与蟾蜍卵母细胞成熟的活性蛋白酶体（265蛋白酶体）的表征”生物医学研究19・4（1998）。

Ryo Horiguchi: "Molecular cloning of the goldfish,Carasius auratus,gene α2-ca encoding a zos proteaseme α-type Subunit and its expression analysis" Zoological Science. 15・5. 773-777 (1998)

Ryo Horiguchi：“金鱼鲫鱼编码zos蛋白酶α型亚基的基因α2-ca的分子克隆及其表达分析”动物学15・5（1998）。

Toshinobu Tokumoto: "Nature and role of proteasomes in maturation of fish oocyces" International Review of Cytology. 186. 261-294 (1999)

Toshinobu Tokumoto：“蛋白酶体在鱼卵母细胞成熟中的性质和作用”国际细胞学评论。