サイクリン分解の分子機構の解析

细胞周期蛋白降解的分子机制分析

• 批准号: 10160210
• 负责人: 徳元 俊伸
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Shizuoka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10160210/
• 关键词: サイクリン; プロテアソーム; タンパク質分解; CDNAクローニング; サイクリン; プロテアソーム; タンパク質分解; CDNAクローニング

サイクリンBの分解は受精直後の卵に見られるばかりでなく、体細胞分裂における分裂期から間期への移行時に普遍的に見られると考えられる。各種変異サイクリンを用いた実験からサイクリンの分解は細胞分裂に必須であることが明らかにされているが、その分解機構に関しては不明な点が多い。申請者は、精製26SプロテアソームがサイクリンBのN末端を限定分解するという結果を得ている。そこで、卵成熟、つまり減数分裂期に重要なプロテアーゼとしてプロテアソームに焦点を絞り、分裂期に必須なサイクリンBのプロテアソームによる分解機構を解明することを目的として研究を進めてきた。これまでにリコンビナントサイクリンBを用いた実験から、26Sプロテアソームがサイクリンの限定分解を介してMPFの不活性化を行なうことを確証した。次にプロテアソームによる限定分解後から完全分解に至る過程がユビキチン系を介するものであるかどうか、卵内のユビキチン化酵素を精製し、サイクリンB分解中間体のユビキチン化を調べることで明らかにする。そこで、まずサイクリンBのユビキチン化部位と想定されているリジンリッチ領域内の6箇所のりジン残基の点突然変異体を作製した。一方、分解に必須であることが示されているサイクリンBのディストラクションボックスの点突然変異体も作製した。これら8種類の点突然変異体を用いた分解実験によりディストラクションボックスは26Sプロテアソームの認識配列にになっていること、N末端から61番目のリジン残基がユビキチン化部位である可能性が高いことが明らかになった。さらに、ユビキチン化酵素の一つであるE2-CのcDNAクローニングにも成功し、他のユビキチン化酵素群の同定も進めている。今後は精製26Sプロテアソームとユビキチン化酵素群を組み合わせた再構成系を構築し、サイクリン分解の分子メカニズムの全体像を明らかにする。

细胞周期蛋白B不仅在受精后立即出现在卵中，而且被认为是在体细胞分裂中从有丝分裂阶段转变为相间的过渡期间普遍看到的。使用各种突变循环的实验表明，细胞周期蛋白的降解对于细胞分裂是必不可少的，但是关于降解机制有许多未知数。申请人发现，纯化的26S蛋白酶体降解了Cyclin B的N末端。因此，我们将蛋白酶体作为一种在卵成熟过程中很重要的蛋白酶，即减数分裂阶段，并一直在进行研究，目的是阐明蛋白酶体的蛋白酶体的机制。先前使用重组细胞周期蛋白B的实验证实，26S蛋白酶体通过细胞周期蛋白的有限降解使MPF失活。接下来，泛素系统介导的蛋白酶体有限降解到完全降解的过程是净化卵中的泛素酶并检查细胞周期蛋白B降解中间体的泛素化。因此，首先，制备了富含赖氨酸的六个胶合5个残基的点突变体，该突变体被假定为细胞周期蛋白B的泛素化位点。另一方面，还产生了细胞周期蛋白B的碎屑盒的点突变体，这些突变体已被证明是降解至关重要的。使用这八个点突变体的降解实验表明，分散箱是26S蛋白酶体的识别序列，而N-末端位置61处的赖氨酸残基很可能是泛素化位点。此外，它已经成功克隆了E2-C的cDNA，E2-C是泛素化酶之一，也正在开发其他泛素化酶基团的鉴定。将来，我们将构建一个重建系统，该系统结合了纯化的26S蛋白酶体和泛素酶基团，以阐明细胞周期蛋白降解的分子机制的整体图。