ポルフィロモナスジンジバリスのヘモグロビン結合性蛋白質の精製と遺伝子クローニング

牙龈卟啉单胞菌血红蛋白结合蛋白的纯化及基因克隆

基本信息

批准号：
08672155
负责人：
天野敦雄
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

有力な歯周病原性菌であるPorphyromonas gingivarlis(P.g.)はその増殖において強い鉄要求性を示し、歯肉溝浸出液中に存在するヘモグロビン、トランスフェリン、ラクトフェリンといった鉄結合性タンパク質をその増殖に利用していると考えられる。また、ヘモグロビンはトランスフェリンやヘミンなどと比してP.g.にとってより有効な鉄源と考えられている。本研究では、P.g.のヘモグロビン獲得機構の一端を明らかとするために、本菌のヘモグロビン結合性タンパク質の精製とその諸性質の検討および分子生物学的検索を目的とした。1)液体培養したP.g.菌体の界面活性剤(CHAPS)処理により外膜タンパク質を分離し、4M尿素存在下でのゲルろ過法、ヘモグロビンアフィニティーカラム、等電点カラムを用いてP.g.のヘモグロビン結合性タンパク質を分離・精製した。2)精製標品の分子量はSDS-PAGEにより51kDa、等電点はpH5.3を示した。ヘモグロビンとの結合における至適pHは、好気的条件下ではpH6.0、嫌気的条件下ではpH7.5であった。3)鉄制限下でのP.g.の培養により菌体内での精製タンパク質の発現が誘導されることが示された。4)精製タンパク質のN末端アミノ酸配列を検索したところ、本標品は既知のP.g.タンパク分解酵素と同一であると考えられ、同酵素の新たなタンパク質機能が明らかとなった。5)本標品と同一分子と考えられるタンパク質のDNA配列にもとづき設計したオリゴヌクレオチドをプライマーとして、PCR法により該当遺伝子を増幅させ、サブクローニング後、形質転換を施したE.coli BL21によりリコンビナントタンパク質を発現させ、同タンパク質を精製した。6)現在リコンビナントタンパク質を用い、精製標品のヘモグロビンとの結合機構について更に検討を加えている。

牙龈卟啉单胞菌（P.G.）是一种领先的牙周致病细菌，在其生长中表现出强烈的铁需求，并使用了诸如血红蛋白，透明蛋白和乳酸蛋白酶的蛋白质，这些蛋白质存在于牙龈凹槽中。与透射蛋白和hemin相比，血红蛋白被认为是P.G的更有效的铁源。在这项研究中，为了阐明P.G.中血红蛋白机制的一端，纯化细菌的血红蛋白结合蛋白的目的，其性质的研究以及分子生物搜索是目的。 1）通过处理液体培养的P.G.的表面活性剂（CHAP），凝胶过滤量，血红蛋白亲和柱的表面活性剂（CHAP）和蛋白质的组合。 2）纯化靶项目的分子量显示为51kDa通过SDS-PAGE，张力为PH5.3。在有氧条件下，与血红蛋白结合的最佳pH为PH6.0，在厌氧条件下pH 7.5。 3）表明，纯化的蛋白在细菌中的表达是由铁系统下的P.G的培养物诱导的。 4）发现纯化的蛋白质的N末端氨基酸序列，被认为与已知的P.G.蛋白质降解酶相同，并且揭示了同一酶的新蛋白质功能。 5）基于蛋白质的DNA序列而设计的寡核苷酸，该蛋白质被认为与该靶项目是相同的分子。由E.Coli BL21表达并完善了相同的蛋白质。 6）目前，我们正在使用重新竞争蛋白质来进一步检查使用纯化物品血红蛋白的结合机制。