銅転送ATPasesの酵素活性測定の開発とウィルソン病、メンケス病の病態解析

铜转移ATP酶酶活性测定的发展以及威尔逊病和门克斯病的病理分析

• 批准号: 08670913
• 负责人: 児玉 浩子
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Teikyo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08670913/
• 关键词: Wilson病; Menkes病; 銅転送ATPase; 活性測定

遺伝子解析からWilson病、Menkes病は銅転送ATPaseの異常であると考えられている。しかし本酵素の活性を検討した報告はない。本研究では本酵素の活性測定法を開発した。材料・方法:正常ヒト、Menkes病患者の培養皮膚線維芽細胞をHoriuchiらの方法で回収しサンプルとした。ATP溶液(1μM)100μlに正常ヒトのサンプル(タンパク量として10〜60μg)、グルタチオン銅(1〜100μM)、ルシフェラーゼ試薬100μlを加え、銅添加によるATPの減少をルシフェラーゼ反応で測定した。添加する銅濃度、サンプル量による変化を検討し、KmおよびVmaxを求め、最も適切な銅濃度とサンプル量を決定した。さらに確立した方法でMenkes病患者サンプルの本酵素活性を測定した。結果・考察:反応液中の銅濃度の変化では、銅濃度が20μMまでは直線的にATPは減少し、それ以上の銅濃度では飽和曲線になった。Lineweavear-BurkdataのプロットからKm=3.85μM,Vmax=10.6nmol/mg protein/minが得られた。サンプル量の変化では、濃度依存性に活性は増加した。これらの結果より、本方法は銅転送ATPaseの活性を測定していると判断できた。さらに活性測定にはサンプル量は12.5μgタンパク量、銅濃度は20μMが最も望ましいと判断された。本方法で測定すると、正常ヒト培養皮膚線維芽細胞の銅転送ATPaseの活性は1397pmol/mg protein/minであった。Menkes病患者の皮膚線維芽細胞を測定すると検出感度以下であり、本方法が銅転送ATPaseの活性を的確に測定していることを裏付ける結果であった。今度正常ヒトやWilson病患者の肝臓での活性測定法も検討する予定である。

遗传分析表明威尔逊氏病和门克斯氏病是由铜转移 ATP 酶异常引起的。然而，还没有研究这种酶活性的报道。在这项研究中，我们开发了一种测量这种酶活性的方法。材料/方法：使用Horiuchi等人的方法收集正常人和门克斯病患者的培养皮肤成纤维细胞并用作样本。将正常人样品（10至60μg蛋白质）、谷胱甘肽铜（1至100μM）和100μl荧光素酶试剂添加到100μl ATP溶液（1μM）中，添加铜导致ATP减少通过荧光素酶反应测定。我们调查了添加的铜浓度和样品量引起的变化，确定了 Km 和 Vmax，并确定了最合适的铜浓度和样品量。此外，我们使用既定方法测量了门克斯病患者样本中的酶活性。结果/讨论：随着反应溶液中铜浓度的变化，ATP 线性下降直至铜浓度为 20 μM，并且在较高铜浓度时出现饱和曲线。从Lineweaver-Burkdata图中得到Km=3.85μM，Vmax=10.6nmol/mg蛋白质/分钟。随着样品量的变化，活性以浓度依赖性方式增加。从这些结果可以得出结论，该方法测量铜转移ATP酶的活性。此外，确定12.5μg蛋白质的样品量和20μM的铜浓度最适合活性测量。当使用该方法测量时，培养的正常人皮肤成纤维细胞的铜转移ATP酶活性为1397 pmol/mg蛋白质/分钟。当测量门克斯病患者的皮肤成纤维细胞时，检测灵敏度低于检测水平，支持该方法准确测量铜转移ATP酶的活性。接下来，我们计划研究测量正常人和威尔逊氏病患者肝脏活动的方法。