赤血球酵素異常症モデルマウスを用いた遺伝子治療の基礎的研究

红细胞酶紊乱模型小鼠基因治疗的基础研究

• 批准号: 08670187
• 负责人: 菅野 仁
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Okinaka Memorial Institute for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08670187/
• 关键词: ピルビン酸キナーゼ; 溶血性貧血; 赤血球; モデルマウス; トランスジェニックマウス; 組織特異的発現; プロモーター; エンハンサー

ヒトピルビン酸キナーゼ(PK)遺伝子発現を規定するエレメントを明らかにする目的で二種類のヒトPKミニ遺伝子を構築し、トランスジェニックマウスを作製した。ヒトPK遺伝子発現はマウス骨髄・網赤血球・肝臓・大腿筋RNAを用いて、ヒトR/L型PKmRNAをRT-PCR法により特異的に増幅することで確認した。ヒトL・R型PK全翻訳領域およびイントロン1・2・11に近位のプロモーター配列を結合したコンストラクト1では、マウス各組織にヒトPK遺伝子の発現は認められなかった。一方上記のコンストラクト1に、R型PK転写開始部位より約4kb上流のDNaseI高感受性領域(HSS)を加えたコンストラクト2を用いて得られた系統(PK-20)には、骨髄・網赤血球にヒトR型、肝にL型PKmRNAを検出できた。本来R/L型PK遺伝子発現の無い筋肉ではPKmRNAは検出されなかった。マウス骨髄・網赤血球中のヒトR型RNAは正常のプロセッシングを受け、翻訳領域の塩基配列にも異常が無いことを確認出来たが、PK-20の赤血球・胎児肝にはヒトR型PK活性は検出できなかった。今回の結果により、ヒトPK遺伝子発現の細胞特異性はコンストラクト2に含まれるエレメント、すなわちプロモーターとHSSで規定されるが、導入されたトランス遺伝子の発現量は低く、PK遺伝子の赤血球系細胞における発現レベルを調節する別のエレメントが存在することが示唆された。

为了阐明调节人丙酮酸激酶（PK）基因表达的元件，我们构建了两种类型的人PK小基因并产生了转基因小鼠。使用小鼠骨髓、网织红细胞、肝脏和大腿肌肉 RNA，通过 RT-PCR 特异性扩增人 R/L 型 PK mRNA，从而证实人 PK 基因表达。在构建体1中，人L/R型PK的整个翻译区和接近内含子1、2和11的启动子序列被组合，在任何小鼠组织中没有观察到人PK基因的表达。另一方面，使用构建体2获得的菌株(PK-20)，其通过在上述构建体1的R型PK转录起始位点上游约4kb处添加DNaseI超敏感区(HSS)而构建，具有在肝脏中检测到对骨髓和网织红细胞具有高敏感性的菌株。在通常不表达 R/L 型 PK 基因的肌肉中未检测到 PK mRNA。证实小鼠骨髓和网织红细胞中人R型RNA加工正常，翻译区碱基序列无异常，但在PK-20红细胞和胎儿中检测到人R型PK活性无法检测到肝脏。目前的结果表明，虽然人PK基因表达的细胞特异性是由构建体2中包含的元件(即启动子和HSS)决定的，但是引入的转基因的表达水平较低，并且PK基因在红系细胞中表达。有人认为还有其他因素可以调节水平。

项目成果

H.Kanno: "Frameshift mutation,exon skipping and a two-codon deletion caused by splice site mutations accont for pyruvate kinase defciency" BLOOD. (in press). (1997)

H.Kanno：“移码突变、外显子跳跃和剪接位点突变引起的双密码子缺失导致丙酮酸激酶缺陷”BLOOD。

H.Kanno: "Molecular analysis of glucose phosphate isomerase deficiency associated with hereditary hemolytic anemia" BLOOD. 88(6). 2321-2325 (1996)

H.Kanno：“与遗传性溶血性贫血相关的葡萄糖磷酸异构酶缺乏症的分子分析”BLOOD。

H.Fujii: "Hematologically important mutations : Molecular abnormalities of glucose phosphate isomerase" Blood Cell Mol Dis. 22(9). 96-97 (1996)

H.Fujii：“血液学重要突变：葡萄糖磷酸异构酶的分子异常”Blood Cell Mol Dis。

A.Hirono: "Three cases of hereditary nonspherocytic hemolytic anemia associated with red blood cell glutathione deficiency" BLOOD. 87(5). 2071-2074 (1996)

A.Hirono：“与红细胞谷胱甘肽缺乏症相关的遗传性非球形细胞溶血性贫血的三例”BLOOD。

S.Miwa: "Molecular basis of erythroenzymopathies associated with hereditary hemolytic anemia : Tabulation of mutant enzymes" Am J Hematol. 51(2). 122-132 (1996)

S.Miwa：“与遗传性溶血性贫血相关的红酶病的分子基础：突变酶列表”Am J Hematol。