血圧調節因子としてのレニン結合タンパク質の機能解析

肾素结合蛋白作为血压调节剂的功能分析

基本信息

批准号：
08660110
负责人：
高橋砂織
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Kyoto Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至 1997
项目状态：
已结题

项目摘要

レニンは非常に特異性の高いアスパルティックプロテアーゼで、主に腎臓において生合成され、様々な刺激で血中に放出され血圧調節を行っている。一方、レニン結合タンパク質(RnBP)はレニンの唯一の内在性阻害物質であり、RnBPはレニンと結合し高分子型レニンを形成することによりレニン活性を強く阻害する。今回、ブタ及びヒトRnBPの大腸菌での発現ベクターを構築するとともに、発現RnBPの精製法を確立した。両RnBPの発現ベクターとしては、我々が開発したtacプロモーターと多コピーのpUC oriを持つpUK223-3を用いた。構築したブタ及びヒトRnBPの発現プラスミドを大腸菌JM109細胞にトランスフォームし、その発現を確認するとともに大腸菌菌体より、超音波破砕、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過やMono Q FPLCなどによりRnBPを精製した。組換え型ブタRnBPの場合には、湿重量32gの菌体より約5mgの精製標品を、また、組換え型ヒトRnBPの場合には、湿重量28gの菌体より約1.3mgの精製標品を取得した。さらに、組換え型ヒトRnBPの抗体を作成し、アビジン-ビオチン系を用いたサンドイッチ法による酵素免疫測定法を確立した。本法の測定感度は、2ng RnBP/wellであり、ヒト各臓器でのRnBPの定量が可能と考えられた。一方、ラットRnBP体細胞遺伝子を単離し、その構造を明らかとした。ラットRnBP遺伝子の全長は約9kbで、11個のエクソンで構成されていた。既に我々により構造が示されているヒトRnBP遺伝子との比較より、翻訳領域のエクソンは両遺伝子で同じ長さを持つことが明らかとなった。したっがて、RnBP遺伝子は種を超えてその構造が保存されていることが示唆された。

肾素是一种高度特异性的天冬氨酸蛋白酶，主要在肾脏中生物合成，并响应各种刺激而释放到血液中以调节血压。另一方面，肾素结合蛋白（RnBP）是肾素唯一的内源性抑制剂，RnBP通过与肾素结合并形成聚合肾素来强烈抑制肾素活性。在本研究中，我们在大肠杆菌中构建了猪和人RnBP的表达载体，并建立了纯化表达的RnBP的方法。作为两种 RnBP 的表达载体，我们使用了 pUK223-3，它具有我们开发的 tac 启动子和多个 pUC ori 拷贝。将构建的猪和人RnBP表达质粒转化大肠杆菌JM109细胞，确认其表达，并通过超声破碎、离子交换层析、凝胶过滤、Mono Q FPLC等方法从大肠杆菌细胞中纯化RnBP。在重组猪RnBP的情况下，从湿重32g的细菌细胞中获得约5mg的纯化产物，在重组人RnBP的情况下，从湿重28g的细菌细胞中获得约1.3mg的纯化样品。得到了该物品。此外，我们创建了针对重组人 RnBP 的抗体，并使用亲和素-生物素系统使用夹心法建立了酶联免疫吸附测定法。该方法的测量灵敏度为2 ng RnBP/孔，并且认为可以量化每个人体器官中的RnBP。同时，我们分离了大鼠RnBP体细胞基因并阐明了其结构。大鼠RnBP基因的总长度约为9 kb，由11个外显子组成。与我们已经展示其结构的人类RnBP基因的比较表明，两个基因中翻译区域的外显子具有相同的长度。因此，有人认为 RnBP 基因的结构在物种间是保守的。