霊長類モデルを用いた腸管化学感覚細胞の分子基盤と生体動態の解明

使用灵长类动物模型阐明肠道化学感应细胞的分子基础和生物动力学

基本信息

批准号：
22KJ1913
负责人：
稲葉明彦
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

腸管Tuft細胞は、受容体を介して寄生虫や微生物由来の腸内物質を化学的に認識し、分泌因子によって免疫細胞の活性化等を誘発することが、最近マウスを用いた研究で明らになった。一方で、ヒトを含む霊長類における腸管tuft細胞が同等の性質を有するかについては不明な点が多い。本研究では、ヒトに近縁な非ヒト霊長類を用いて、霊長類におけるTuft細胞の機能解明を目的とした。当該年度においては、まず、申請者らが報告した手法を用いてアカゲザル（Macaca mulatta）及びニホンザル（Macaca fuscata）の腸管組織から作製した腸管オルガノイドを培養し、同培養系に対して、CISPR-Cas9システム等を応用して遺伝子改変を行い、Tuft細胞特異的にレポーター遺伝子（蛍光物質・薬剤耐性遺伝子）を導入した新規解析系を樹立を行った。具体的には、Cas9タンパク質および標的遺伝子特異的gRNAを発現するCas9ベクター、レポーター遺伝子配列を含むノックインドナーベクターをそれぞれを設計し、エレクトロポレーション法を用いて細胞内に導入した。その後、薬剤選択培養によって遺伝子導入された細胞株を選別した。得られた薬剤耐性細胞株からゲノムDNA抽出し、それらを鋳型に遺伝子挿入領域をPCRおよびサンガーシーケンシングによって解析した結果、ターゲットゲノム領域に対する外来DNA配列の欠損のない挿入を確認した。ノックイン細胞株においてTuft細胞分化誘導培養を行った結果、オルガノイド中に蛍光物質陽性細胞の出現を確認した。またそれら陽性細胞がTuft細胞マーカー分子を共発現することを免疫蛍光染色によって確認した。したがって、マカク腸管オルガノイドにおいてTuft細胞を特異的に標識した新規遺伝子改変株の樹立に成功した。

最近使用小鼠进行的研究表明，肠道簇细胞通过受体对来自寄生虫和微生物的肠道物质进行化学识别，并通过分泌因子诱导免疫细胞活化。另一方面，目前还不清楚灵长类动物（包括人类）的肠道簇细胞是否具有类似的特性。在这项研究中，我们旨在利用与人类密切相关的非人类灵长类动物来阐明灵长类动物簇绒细胞的功能。在本财年，我们首先使用申请人报告的方法培养了由恒河猴（Macaca mulatta）和日本猴（Macaca fuscata）的肠道组织制备的肠道类器官，并将CISPR-Cas9应用于相同的培养系统。建立了分析系统，其中通过应用该系统对报告基因(荧光物质/耐药基因)进行基因修饰，将报告基因特异性地引入簇细胞中。具体来说，设计了表达Cas9蛋白和靶基因特异性gRNA的Cas9载体和含有报告基因序列的敲入供体载体，并使用电穿孔将其引入细胞中。此后，通过药物选择培养来选择已导入基因的细胞系。从获得的耐药细胞系中提取基因组DNA，并以该DNA为模板通过PCR和桑格测序分析基因插入区域，结果将外源DNA序列无缺失地插入到目标基因组区域中。确认的。作为敲入细胞系中簇细胞分化诱导培养的结果，我们确认了类器官中荧光物质阳性细胞的出现。免疫荧光染色也证实这些阳性细胞共表达簇细胞标志分子。因此，我们成功建立了一种特异性标记簇细胞的新型转基因猕猴肠道类器官品系。