正確な染色体分配を保証する新たな中心体ポジショニング機構の解明

阐明确保染色体精确分离的新中心体定位机制

• 批准号: 22KJ1178
• 负责人: 小森 琢磨
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1178/
• 关键词: 中心体; 細胞分裂

中心体は動物細胞小器官の一つであり、細胞分裂における紡錘体の極として機能する。これまで様々ながん細胞株を対象とした解析から、分離した2つの中心体は、核の下から核を挟むように側面へと移動して核膜崩壊を迎えると考えられてきた。その一方で、正常細胞株では、核膜崩壊時にそれぞれの中心体が核の上下に配置されることも示されている。しかし、この中心体の特徴的な配置の分子機構やその意義は全くの未解明である。本研究では、この特徴的な核膜崩壊時の中心体配置の分子機構を明らかにすることを目的とした。当該年度は以下の実験を行った。1.核膜崩壊直前の特徴的な中心体配置を決定する因子の同定：複数の中心体関連因子対象とした小規模siRNAスクリーニングを実施し、この現象における主要因子の同定に取り組んだ。ここではZ軸解像度の高い顕微鏡を用いてそれぞれの処理群に対する正確な評価を行った。その結果、複数の因子において中心体の特徴的な配置が減少することが確認された。2.候補因子のノックアウト細胞株の樹立：得られた候補因子に対し、自身が最適化した手法であるCRISPR-del法を用いてノックアウト細胞株を樹立した。これは標的遺伝子の上流・下流をターゲットとする二種類のsgRNAを同時に導入することで標的遺伝子の全長を欠損させる方法である。これにより、”完全なノックアウト細胞株”の作成に成功し、候補因子の欠損による表現系がsiRNAのオフターゲットである可能性が排除された。3.ライブセルイメージング系の確立：上記の細胞株に対して中心体と核に蛍光タンパク質を発現する細胞株を作成し、ライブセルイメージングによる解析を行った。これによりノックアウト細胞株中での実際の中心体動態や細胞周期全体に対する影響を詳細に解析することが可能になった。

中心体是动物细胞中的细胞器之一，在细胞分裂过程中充当纺锤体的极点。先前对各种癌细胞系的分析表明，两个分离的中心体从细胞核下方移动到两侧，将细胞核夹在中间，导致核膜塌陷。另一方面，还表明，在正常细胞系中，在核膜塌陷期间，每个中心体位于细胞核的上方和下方。然而，中心体这种特征排列的分子机制和意义尚不清楚。在这项研究中，我们的目的是阐明核膜塌陷过程中这种特征性中心体排列的分子机制。年内进行了以下实验。 1.确定核膜塌陷前决定中心体特征位置的因素：我们针对多个中心体相关因素进行了小规模的siRNA筛选，以确定参与这种现象的主要因素。在这里，我们使用具有高 Z 轴分辨率的显微镜对每个治疗组进行了准确的评估。结果证实，中心体的特征排列因多种因素而降低。 2.候选因子敲除细胞系的建立：利用他优化的方法CRISPR-del方法，对获得的候选因子建立了敲除细胞系。这是一种通过同时引入针对靶基因上游和下游的两种类型的 sgRNA 来删除靶基因全长的方法。结果，我们成功创建了“完全敲除细胞系”，并消除了由于候选因子缺失而导致表达系统出现siRNA脱靶的可能性。 3.活细胞成像系统的建立：我们从上述细胞系中创建了在中心体和细胞核中表达荧光蛋白的细胞系，并通过活细胞成像对其进行分析。这使得详细分析实际中心体动力学以及对敲除细胞系中整个细胞周期的影响成为可能。

项目成果

A CRISPR-del-based pipeline for complete gene knockout in human diploid cells

基于 CRISPR-del 的人类二倍体细胞完全基因敲除管道

• DOI: 10.1242/jcs.260000
• 发表时间: 2023
• 影响因子: 4
• 作者: Komori Takuma;Hata Shoji;Mabuchi Akira;Genova Mariya;Harada Tomoki;Fukuyama Masamitsu;Chinen Takumi;Kitagawa Daiju
• 通讯作者: Kitagawa Daiju

核膜崩壊時の特徴的な中心体配置の分子機構の解明

阐明核膜塌陷过程中特征中心体排列的分子机制

• 发表时间: 2022
• 作者: 小森琢磨; 畠星治; 北川大樹
• 通讯作者: 北川大樹