進化工学を用いた人工DNAゲノム機能発現の最適化

利用进化工程优化人工DNA基因组功能表达

基本信息

批准号：
22KJ0540
负责人：
古林太郎
金额：
$ 2.33万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

2022年度は、前年度に最適化したphi29複製系を進化に必須となる微小区画(w/oエマルション)系に持ち込むための検討を行った。申請時は野地研の独自技術である微小リアクタデバイスを用いる予定であったが、ホモジェナイザーを用いてエマルションを生成する方法が本研究で用いる自己複製系との相性がよく、進化サイクルを複数ラウンドにわたって高速に回せる、より大きなライブラリーサイズを確保できる、微小液滴サイズを非常に小さくできるなどの性質の良さを重視してこの手法を選択した。phi29複製反応がうまく動作するようなエマルションの作成法を検討し、複製が高効率で動作するような生化学的条件を同定した。次に、このエマルションが微小区画として重要な2つの機能を果たせるかどうかを検討した。1つ目は「微小空間による1分子の濃縮効果」である。進化にあたっては1区画あたり1コピーのDNAから自己複製反応を行う必要があるが、DNA濃度が低すぎると翻訳されたタンパク質とDNAが出会えず、複製が起こらないことが知られている。私はDNAをpM以下の濃度にした複製反応をバルク・区画化条件で比較し、区画化条件でのみ複製が起こることから、区画が確かに微小反応場として動作していることを確認した。2つ目は、「機能性DNAの選択的増幅」である。進化実験の入力として与えられる変異体ライブラリ中のDNAは多くが遺伝子機能の壊れた配列であり、野生型より高機能な配列はごく稀である。したがって、微小区画によってDNA集団を確実に1コピーずつ隔離し、遺伝子機能を向上させたDNAだけを効率よく選択する必要がある。私は複製起点Oriをもつ自己複製DNA(DNAポリメラーゼをコード)と、蛍光タンパク(複製に関係ない疑似遺伝子)をコードしたDNA集団を混合して区画内複製反応を行い、確かに自己複製DNAだけが選択的に増幅されることを確かめた。

2022财年，我们进行了一项研究，将前一年优化的phi29复制系统引入进化所必需的微室（w/o乳液）系统中。在申请时，我们计划使用微反应器装置，这是野寺实验室的独特技术，但使用均质器生成乳液的方法与本研究中使用的自我复制系统兼容，并且是可能的我们选择这种方法是因为它具有良好的特性，例如能够高速运行多轮，保证更大的文库尺寸，并使微滴尺寸极小。我们研究了一种创建乳液的方法，该乳液可以使 phi29 复制反应顺利进行，并确定了可以使复制高效进行的生化条件。接下来，我们研究了这种乳液是否可以作为微室发挥两个重要功能。第一个是“单个分子由于微观空间而产生的浓缩效应”。在进化过程中，自我复制反应需要每个区室的一份DNA进行，但众所周知，如果DNA浓度太低，翻译的蛋白质和DNA将无法相遇，复制将无法进行。发生。我比较了在批量和区室化条件下浓度低于 pM 的 DNA 的复制反应，并且由于复制仅在区室化条件下发生，我证实区室确实作为微反应场发挥作用。第二个是“功能DNA的选择性扩增”。作为进化实验输入的突变文库中的大多数DNA都是基因功能被破坏的序列，而比野生型具有更高功能的序列极其罕见。因此，有必要使用微区室可靠地分离DNA群体的每个拷贝，并有效地仅选择具有改善的基因功能的DNA。我通过将自我复制DNA（编码DNA聚合酶）与复制起点Ori和编码荧光蛋白（与复制无关的假基因）的DNA群体混合来进行区室内复制反应，并确认仅存在自我复制DNA。进行选择性扩增。