月面閉鎖生態系の構築を目指した改変型シアノバクテリアの設計

设计改良蓝藻以创建封闭的月球生态系统

基本信息

批准号：
22K19279
负责人：
秋山修志
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Institute for Molecular Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19279/
关键词：
概日時計シアノバクテリア

项目摘要

シアノバクテリアの概日時計を改変して月面環境サイクル耐性を付与するために、我々が保有する周期変異体ライブラリからKaiCの長周期変異をリストアップし、それらを複数導入したKaiC多重変異体の候補を設計した。また、別の視点からも長周期変異の候補を検証した。他種シアノバクテリア由来のKaiCのアミノ酸配列、機能、活性を参照しつつ、本課題の目的に沿ったアミノ酸変異の候補を調べた。著しい長周期化をもたらす変異は確認されなかったが、長周期化傾向を示す変異群が一部見られたため、それらについては加算的に導入することで一定の効果が期待できる。既知のX線結晶構造をもとに、候補となる多重変異が著しい構造不安定化や機能失活をもたらす可能性がないか、これまでの経験等を踏まえつつ検証した。一方、長時間にわたる機能評価・スクリーニングをより効率よく行うための実験系の確立に向けて検討を行った。指標としては、KaiC単独のATPase活性とリン酸化サイクルの周期が候補となる。著しく高いATPase活性を示す変異体、もしくは著しく短周期化された変異体をテンプレートとし、そこに候補となる長周期変異を導入して効果を検証することにより、機能評価・スクリーニングに要する時間がある程度短縮される可能性がある。そこでテンプレート用に、温度補償性を有する短周期KaiC変異体（ATPase活性2倍、周期8時間）を設計・調製した。以上、月面適応型概月時計の設計に向けて、短周期変異体を鋳型とする多重長周期変異の迅速探索基盤が整った。

为了修改蓝细菌的生物钟并赋予其对月球环境循环的抵抗力，我们从周期性突变体库中列出了 KaiC 长周期突变，并创建了 KaiC 多重突变体，引入了其中的多个候选突变体。我们还从另一个角度研究了长周期突变的候选者。在参考来自其他蓝藻物种的KaiC的氨基酸序列、功能和活性的同时，我们研究了符合本项目目的的氨基酸突变候选者。虽然没有发现显着延长周期的突变，但存在一些表现出延长周期的倾向的突变，并且通过附加引入这些突变可以期待一定的效果。基于已知的X射线晶体结构，我们结合过去的经验，检查了候选多重突变是否会导致显着的结构不稳定或功能失活。另一方面，我们研究建立实验体系，以更有效地进行长期功能评估和筛选。候选指标包括单独的 KaiC 的 ATP 酶活性和磷酸化周期的周期。通过以ATP酶活性显着高的突变体或周期显着缩短的突变体为模板，将候选长周期突变体引入其中，并验证效果，可以将功能评估和筛选所需的时间缩短到一定程度。程度可能会缩短。因此，我们设计并制备了温度补偿短周期KaiC突变体（双ATP酶活性，8小时周期）作为模板。如上所述，以短周期突变体为模板快速探索多种长周期突变的基础已经为设计适应月球表面的生物钟奠定了基础。