ラジカル架橋酵素により構築した生理活性環状化ペプチドの作用機構解析と最適化

自由基交联酶构建生物活性环化肽的机理分析与优化

基本信息

批准号：
22K19150
负责人：
岡島俊英
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

酵素の翻訳後修飾に関わるラジカル架橋酵素QhpDは、タンパク質に分子内チオエーテル架橋を形成し、ループ型環状構造を多重に作り出すことができる。本研究は、このQhpDを利用することによって、酵素的なペプチド環状化手法を開発し、新規な機能性を持つ環状ペプチドを作り出すことを目的とする。すなわち、新しい中分子創薬のフレームワークとして重要な意義がある。まず、アラニン残基を連続したAla環状化ペプチドの動物細胞に対する作用の解析、あるいは物理化学的な解析を行うために、(Ala)4, (Ala)5, (Ala)6ペプチドの調製を行なった。特にNMRによる2価金属イオンとの相互作用解析に多量の試料が必要とされることが判明しており、本年度においてその調製に注力した。概ね次年度より本格的な解析を開始できるものと考えている。さらに、架橋酵素QhpDの発現を制御し、架橋ペプチドの環状化をon/offできる共発現系の構築を試みた。当初計画では、QhpDの発現制御を、大腸菌コールドショック遺伝子cspAのプロモーター配列（pColdベクター使用）で行うことを計画していたが、pColdベクターの誘導条件である15 ℃では、T7プロモーター支配下の架橋ペプチドの発現が停止し、共発現系が想定通りに機能しなかった。そこで、QhpDの発現制御を、pBADプラスミド上でアラビノースプロモーター支配下で行うようにした。その結果、IPTG誘導下架橋ペプチドを発現下させているところに、アラビノースの有無によって、架橋酵素の発現をon/offできることがわかった。本系を用いることで、新規抗菌性ペプチドの探索に向けた基盤を確立することができた。

QhpD 是一种参与酶翻译后修饰的自由基交联酶，可在蛋白质中形成分子内硫醚交联，并可产生多个环状结构。本研究的目的是开发一种使用 QhpD 的酶促肽环化方法，并创建具有新功能的环肽。换句话说，它作为新中分子药物发现的框架具有重要意义。首先，为了分析具有连续丙氨酸残基的Ala环化肽对动物细胞的影响或进行理化分析，我们制备了(Ala)4、(Ala)5和(Ala)6肽Ta。特别是，我们发现通过NMR进行与二价金属离子的相互作用分析需要大量的样品，今年我们重点准备了它。我们相信大约从明年开始我们就能开始全面的分析。此外，我们尝试构建一个共表达系统，可以控制交联酶QhpD的表达并打开/关闭交联肽的环化。最初，我们计划使用大肠杆菌冷休克基因cspA的启动子序列（使用pCold载体）来控制QhpD的表达，但在15°C（这是pCold载体的诱导条件）下交联T7启动子的控制肽表达停止，共表达系统未按预期发挥作用。因此，我们在阿拉伯糖启动子的控制下控制pBAD质粒上QhpD的表达。结果发现，当交联肽在IPTG诱导下表达时，交联酶的表达可以根据阿拉伯糖的存在或不存在而开启或关闭。通过使用该系统，我们能够为寻找新的抗菌肽奠定基础。