血管平滑筋細胞の形質変換誘導機構の分子生物学的解析

血管平滑肌细胞转化诱导机制的分子生物学分析

• 批准号: 07858075
• 负责人: 小亀 浩市
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: National Cardiovascular Center Research Institute
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07858075/
• 关键词: 細胞培養; 血管平滑筋細胞; 細胞外マトリクス; 動脈硬化; PTCA後再狭窄; 遺伝子発現; mRNA; Differential Display法

粥状動脈硬化症や経皮的冠動脈形成術(PTCA)後再狭窄の発症・進展には、血管平滑筋細胞が本来筋繊維に富む収縮型から増殖能をもつ合成型へ形質変換することが関与している。しかし現在のところ、どのようなメカニズムで平滑筋細胞の表現型が変換するのか明らかにされていない。本研究では、周囲の環境変化が血管平滑筋細胞に及ぼす影響を調べるため、平滑筋細胞培養系を利用し、外界の変化に伴って発現状態が変化する遺伝子の探索を目的とした。まず、正常ヒト大動脈由来平滑筋細胞を種々の細胞外マトリクス(コラーゲンTypeI、コラーゲンTypeIV、ラミニン、フィブロネクチン)で表面処理したプラスチックディッシュ上に培養した。なお本実験の条件下ではラミニン処理ディッシュには平滑筋細胞はほとんど付着せず、増殖しなかった。次に、細胞がコンフルエントに達した時点で細胞からRNAを抽出し、近年開発されたmRNA Differential Display法を行った。本研究においては、特に迅速性を目的として様々な改良を加えた方法で行った。それぞれの細胞から得たRNAに対するcDNA群を9種類のプライマーを用いて作成し、さらにこれを鋳型として24種類のプライマーを用いたPCR(計648反応)を行った。これらPCR産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析し、細胞外マトリクスの違いによって発現量の変化するmRNAを探索した。本方法で3,000-5,000ものバンドを比較することができたが、発現量に差が確認できるmRNAは検出されなかった。この結果は、培養開始時の細胞外マトリクスの違いはコンフルエントに達した平滑筋細胞に機能上の違いをもたらしていないことを示唆している。ただし、ラミニン処理ディッシュに細胞が付着しなかったことを考慮すると、培養の初期段階にはmRNAの発現レベルでの違いがある可能性も残っており、今後の課題として検討するべきである。なお、本研究の遂行過程において利用したDNAの高感度染色剤についての使用法・応用法を記述した総説を執筆し、日本血栓止血学会誌に掲載された。

动脉粥样硬化和经皮冠状动脉成形术（PTCA）后再狭窄的发作和发育涉及使血管平滑肌细胞从收缩形式的转化，这些形式自然富含肌肉纤维到具有增殖势的合成形式。但是，目前尚未揭示如何转化平滑肌细胞表型的机制。在这项研究中，我们使用平滑肌细胞培养系统来搜索其表达变化随环境中的外部变化而变化的基因，以研究周围环境对血管平滑肌细胞的影响。首先，将源自正常人主动脉的平滑肌细胞在表面处理的塑料菜肴上培养，这些塑料用各种细胞外基质（胶原型I型，IV型胶原蛋白，IV型，层粘连蛋白，纤连蛋白）培养。在该实验的条件下，几乎没有平滑肌细胞连接到层粘连蛋白处理的菜肴上，并且没有增殖。接下来，当细胞达到汇合时，从细胞中提取RNA和最近开发的mRNA差异显示方法。在这项研究中，进行了各种改进，尤其是为了速度。使用九种类型的引物制备了从每个细胞获得的RNA的一组CDNA，然后使用该模板作为模板进行了24种引物（总共648个反应）。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析这些PCR产物，以搜索其表达水平根据细胞外基质而变化的mRNA。尽管该方法用于比较3,000-5,000个频段，但未检测到可以证实表达水平差异的mRNA。该结果表明，培养开始时细胞外基质的差异并不能导致平滑肌细胞的功能差异。但是，考虑到细胞不遵守层粘连蛋白处理的菜肴，因此在培养的早期阶段仍然可能存在mRNA表达水平差异，因此应将其视为未来的问题。此外，这项研究过程中使用的高度敏感DNA染色剂的使用和应用的综述发表在《日本血栓形成和止血疾病学会杂志》上。

项目成果

宮田敏行・小亀浩市: "高感度DNA染色剤を用いたSSCP解析" 日本血栓止血学会誌. 6. 292-294 (1995)

Toshiyuki Miyata 和 Hiroichi Ogame：“使用高度敏感的 DNA 染色进行 SSCP 分析”日本血栓和止血学会杂志 6. 292-294 (1995)。