酵母と老化と活性酸素によるミトコンドリアDNAの損傷に及ぼすグルタチオンの影響

谷胱甘肽对酵母、衰老和活性氧引起的线粒体 DNA 损伤的影响

基本信息

批准号：
07760087
负责人：
井上善晴
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Saccharomyces cerevisiaeの酸化的ストレス応答におけるグルタチオン(GSH)の重要性を検討するため、カタラーゼ(CTT1)とGSHの合成系の律速酵素であるγ-グルタミルシステイン合成酵素遺伝子(GSH1)のknockout mutantを作成し、それらのH_2O_2ストレスに対する応答を検討した。その結果、カタラーゼを破壊しても細胞は野生株と同等のH_2O_2耐性、並びにH_2O_<>ストレスに対するadaptation(微弱な1次ストレス処理による致死的な2次ストレスに対する耐性の獲得)を示した。これに対し、gsh1Δ変異株ではH_2O_2に対する感受性が極端に増大し、adaptationも全く獲得することができなくなった。これらのことから、S. cerevisiaeでは酸化的ストレス応答にGSHが重要な役割を果たしていることを確認できた。次に酵母の老化と酸化的ストレス応答について検討した。出芽を繰り返した細胞と、一度も出芽を経験していない未出芽細胞を、その細胞サイズを指標に分画した。出芽を繰り返した細胞をキチンに特異的な蛍光色素で染色し蛍光顕微鏡下で観察すると、その細胞表面は出芽痕によって覆われていた。出芽を繰り返した細胞と未出芽細胞の酸化的ストレスに対する耐性とadaptationについて比較した。その結果、出芽を繰り返した細胞の方が酸化的ストレスに対する耐性、adaptation能ともに高かった。H_2O_2を消去する酵素であるカタラーゼやチトクロームcペルオキシダーゼ遺伝子の発現レベルに及ぼす酸化的ストレスの影響を検討した。出芽を繰り返した細胞と未出芽細胞でそれらの遺伝子のmRNAレベルに変化は認められなかったのに対し、細胞内GSH含量については前者は後者より高い傾向を示した。そこで、出芽を繰り返した細胞と未出芽細胞の酸化的ストレス負荷後の呼吸欠損株(=ミトコンドリア変異株)の出現を比較することにした。しかし今回実験に供したS. cerevisiae YPH250株(Yeast Genetic Stock Center, University of California at Berkeley, California)ha10〜20%の呼吸欠損株を最初から含んでいた。培養をグリセロール培地で行うことによりspontaneousな呼吸欠損株の出現頻度を5%程度にまで低減させることができたが、酵母の老化における呼吸欠損株の出現頻度と酸化的ストレスとの直接的な関係を検討するには至らなかった。そこで酵母の生育期の違いによる酸化的ストレスによる呼吸欠損株の誘導を比較した。その結果、対数生育期の細胞の方が定常期の細胞より呼吸欠損株の出現頻度が高かった。

为了研究谷胱甘肽（GSH）在酿酒酵母氧化应激反应中的重要性，我们创建了γ-谷氨酰半胱氨酸合酶基因（GSH1）的敲除突变体，该基因是过氧化氢酶合成系统中的限速酶（ CTT1)和GSH，研究了它们对H_2O_2应激的反应。结果，即使过氧化氢酶被破坏，细胞也表现出与野生型菌株相当的H_2O_2耐受性，以及对H_2O_<>应激的适应能力（由于初级应激处理较弱而获得对致死性次级应激的耐受性）。另一方面，gsh1Δ突变株对H_2O_2的敏感性极大增加，根本无法获得适应。这些结果证实GSH在酿酒酵母的氧化应激反应中发挥重要作用。接下来，我们研究了酵母老化和氧化应激反应。以细胞大小为指标，分离出反复出芽的细胞和从未出芽的未出芽细胞。当经过反复出芽的细胞用几丁质特异性荧光染料染色并在荧光显微镜下观察时，细胞表面布满了出芽疤痕。我们比较了经历反复出芽和未出芽细胞的氧化应激抵抗力和适应能力。结果，经历反复出芽的细胞具有更高的抗氧化应激能力和适应能力。我们研究了氧化应激对过氧化氢酶和细胞色素 c 过氧化物酶基因表达水平的影响，这些基因是清除 H_2O_2 的酶。虽然经过反复出芽的细胞和未出芽的细胞之间这些基因的mRNA水平没有观察到变化，但前者的细胞内GSH含量往往高于后者。因此，我们决定比较经过反复出芽的细胞和未出芽细胞中氧化应激负荷后呼吸缺陷菌株（=线粒体突变体）的外观。然而，本实验中使用的菌株S. cerevisiae YPH250（加州大学伯克利分校酵母遗传库存中心，加利福尼亚州）最初含有10-20%的具有呼吸缺陷的菌株。通过在甘油培养基中培养，我们能够将自发呼吸缺陷菌株的频率降低至约 5%，但我无法确定呼吸缺陷菌株的频率与酵母老化过程中的氧化应激之间存在直接关系。考虑一下。因此，我们比较了不同酵母生长季节氧化应激对呼吸缺陷菌株的诱导。结果，对数生长期细胞中呼吸缺陷菌株的频率高于稳定期细胞。