酵母と老化と活性酸素によるミトコンドリアDNAの損傷に及ぼすグルタチオンの影響

谷胱甘肽对酵母、衰老和活性氧引起的线粒体 DNA 损伤的影响

• 批准号: 07760087
• 负责人: 井上 善晴
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07760087/
• 关键词: Saccharomyces cerevisiae; 酸化的ストレス; グルタチオン; ミトコンドリア; カタラーゼ; チトクローム c ペルオキシダーゼ; 呼吸欠損変異; 過酸化水素; Saccharomyces cerevisiae; 酸化的ストレス; グルタチオン; ミトコンドリア; カタラーゼ; チトクローム c ペルオキシダーゼ; 呼吸欠損変異; 過酸化水素

Saccharomyces cerevisiaeの酸化的ストレス応答におけるグルタチオン(GSH)の重要性を検討するため、カタラーゼ(CTT1)とGSHの合成系の律速酵素であるγ-グルタミルシステイン合成酵素遺伝子(GSH1)のknockout mutantを作成し、それらのH_2O_2ストレスに対する応答を検討した。その結果、カタラーゼを破壊しても細胞は野生株と同等のH_2O_2耐性、並びにH_2O_<>ストレスに対するadaptation(微弱な1次ストレス処理による致死的な2次ストレスに対する耐性の獲得)を示した。これに対し、gsh1Δ変異株ではH_2O_2に対する感受性が極端に増大し、adaptationも全く獲得することができなくなった。これらのことから、S. cerevisiaeでは酸化的ストレス応答にGSHが重要な役割を果たしていることを確認できた。次に酵母の老化と酸化的ストレス応答について検討した。出芽を繰り返した細胞と、一度も出芽を経験していない未出芽細胞を、その細胞サイズを指標に分画した。出芽を繰り返した細胞をキチンに特異的な蛍光色素で染色し蛍光顕微鏡下で観察すると、その細胞表面は出芽痕によって覆われていた。出芽を繰り返した細胞と未出芽細胞の酸化的ストレスに対する耐性とadaptationについて比較した。その結果、出芽を繰り返した細胞の方が酸化的ストレスに対する耐性、adaptation能ともに高かった。H_2O_2を消去する酵素であるカタラーゼやチトクロームcペルオキシダーゼ遺伝子の発現レベルに及ぼす酸化的ストレスの影響を検討した。出芽を繰り返した細胞と未出芽細胞でそれらの遺伝子のmRNAレベルに変化は認められなかったのに対し、細胞内GSH含量については前者は後者より高い傾向を示した。そこで、出芽を繰り返した細胞と未出芽細胞の酸化的ストレス負荷後の呼吸欠損株(=ミトコンドリア変異株)の出現を比較することにした。しかし今回実験に供したS. cerevisiae YPH250株(Yeast Genetic Stock Center, University of California at Berkeley, California)ha10〜20%の呼吸欠損株を最初から含んでいた。培養をグリセロール培地で行うことによりspontaneousな呼吸欠損株の出現頻度を5%程度にまで低減させることができたが、酵母の老化における呼吸欠損株の出現頻度と酸化的ストレスとの直接的な関係を検討するには至らなかった。そこで酵母の生育期の違いによる酸化的ストレスによる呼吸欠損株の誘導を比較した。その結果、対数生育期の細胞の方が定常期の細胞より呼吸欠損株の出現頻度が高かった。

为了研究谷胱甘肽（GSH）在酿酒酵母的氧化应激反应中的重要性，我们创建了γ-谷氨酰基半胱氨酸合酶基因（GSH1）的基因敲除突变体（速率限制酶），这是一种限制酶（一种对催化酶（Catalase）的合成（CTT1）的合成（CTT1）和GSH和GSH和GSH，并响应H__2的2O_2。结果，即使过氧化氢酶被破坏，细胞也表现出对H_2O_2的耐药性，以及对H_2O _ <>胁迫的适应（由于弱原发性压力治疗而导致致命的次应力的耐受性积累）。相反，GSH1δ突变菌株已急剧增加到对H_2O_2的敏感性，因此无法获得适应性。这些发现证实，GSH在酿酒酵母中的氧化应激反应中起着重要作用。接下来，检查了酵母老化和氧化应激反应。反复出现和突出从未经历过萌芽的细胞的细胞以其细胞大小作为指数进行了分级。反复发芽的细胞用几丁质特异性荧光染料染色，并在荧光显微镜下观察，并发现细胞表面被萌芽的标记覆盖。比较了对氧化应激的耐药性和反复出现细胞和脉动细胞的适应性。结果，反复发芽的细胞更有可能对氧化应激和适应能力具有更大的抵抗力。我们研究了氧化应激对酶过氧化酶和细胞色素C过氧化物酶基因的表达水平的影响，这些酶是擦除H_2O_2的酶。尽管这些基因的mRNA水平在反复发芽和脉动细胞的细胞中未观察到变化，但前者比后者显示出更高的细胞内GSH含量。因此，我们决定比较呼吸不足菌株（=线粒体突变菌株）的出现，后者反复萌芽和脉动细胞的细胞氧化应激负荷。然而，从实验开始，加利福尼亚大学酵母遗传储备中心，加利福尼亚大学的酵母遗传储备中心开始包括10-20％的呼吸缺乏症。通过在甘油培养基中进行培养，可以将自发呼吸有缺陷菌株的频率降低到约5％，但是在酵母菌衰老期间呼吸道缺陷菌株的频率与氧化应激之间的直接关系是不可能的。因此，我们比较了由于酵母生长周期的差异，由于氧化应激引起的呼吸道缺陷菌株的诱导。结果，对数生长阶段中的细胞显示出呼吸缺陷菌株的频率高于固定阶段的细胞。