殺虫剤BHC分解に関与するPseudomonas属細菌の新規脱塩素酵素系の解析

假单胞菌新型脱氯酶系统参与杀虫剂六六六降解的分析

• 批准号: 07760075
• 负责人: 永田 裕二
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07760075/
• 关键词: BHC; Pseudomonas; dehalogenase; biodegradation

BHCを好気的に分解資化するという大変ユニークな性質を持つPseudomonas paucimobilis UT26が有する脱塩素酵素反応を触媒する酵素の性質についての解析を行った。まず,BHCから直接脱塩化水素を行うdehydrochlorinase (LinA)と次の段階の加水分解的脱塩素反応を行うhydrolytic dehalogenase (LinB)の相互作用を検討するために,量酵素をコードする遺伝子をタンデムに結合し,tac プロモーターを利用して両遺伝子を大腸菌中で同時に高発現させた。粗酵素抽出液に両酵素の活性が検出されたために,この抽出液から両タンパク質の精製を試みた。硫安分画を行ったところ,両酵素活性性は異なる画分に検出された。すなわち,当初予想された両酵素が複合体を形成し,一連の脱塩素反応を行っている可能性は低いと思われた。そこで,以下は,その酵素学的特徴について解析が不十分である,LinB酵素に的を絞って解析を行った。すなわち,クローン化した遺伝子を用いてLinB蛋白を大腸菌内で大量に生産し、これを硫安分画,疎水クロマト,陰イオン交換クロマト,ゲルろ過の各ステップを経て,SDS-PAGE上で単一のバンドとなるまで精製した。その酵素学的解析を行ったところ,約30-kDの単量体であること,至適pHが8.2であることなどの特徴は,既に酵素学的解析が行われているLinBと推定アミノ酸配列において有意な相同性を示すhaloalkane dehalogenase, DhlAと類似の特徴を示したが,基質特異性においては顕著な違いが観察された。すなわち,DhlAが鎖長の短いhaloalkaneを良い基質とするのに対して,LinBは比較的鎖長の長居haloalkaneを良い基質とした。推定アミノ酸配列の違いと,基質特異性の違いの対応関係はコンピューター解析によって推定されるものとよく一致し,本申請研究において,今後,dehalogenaseの構造・機能相関を明らかにしていくための十分な下地を確立することができた。

我们分析了少动假单胞菌UT26所具有的催化脱氯酶反应的酶的性质，该酶具有好氧分解和同化六六六的独特性质。首先，为了研究直接脱氯化氢的脱氯酶（LinA）和执行下一步水解脱氯的水解脱卤酶（LinB）之间的相互作用，我们串联产生了编码这些酶的基因，这两个基因被组合并同时进行。使用 tac 启动子在大肠杆菌中高水平表达。由于在粗酶提取物中检测到了两种酶的活性，因此我们尝试从该提取物中纯化两种蛋白质。当进行硫酸铵分级分离时，在不同的级分中检测到两种酶的活性。换句话说，这两种酶似乎不太可能像最初预期的那样形成复合物并进行一系列脱氯反应。因此，我们将分析重点放在LinB酶上，但其酶学特性尚未得到充分分析。即利用克隆的基因在大肠杆菌中大量产生LinB蛋白，然后经过硫酸铵分级分离、疏水层析、阴离子交换层析和凝胶过滤的步骤，然后在SDS上作为单一蛋白进行分析-PAGE。将其纯化直至形成条带。经过酶分析，我们发现其特征，例如大约30-kD的单体和最佳pH为8.2，与已经进行酶分析的LinB相似，并且其预测的氨基酸序列也显示出相似。与 DhlA（一种卤代烷脱卤酶）具有显着的同源性，但在底物特异性方面观察到显着差异。换句话说，DhlA使用短链卤代烷作为良好的底物，而LinB使用相对长链的卤代烷作为良好的底物。推导的氨基酸序列的差异和底物特异性的差异之间的对应关系与计算机分析估计的结果非常一致，并且这项研究足以阐明未来脱卤酶的结构与功能关系。奠定基础。

项目成果

Yutaka Kikuchi: "Pseudomonas fluorescens KKLlol, a benzoic acid degrader in a mixed culture that deyrades biphenyl and polychlorinated biphenyls." Biosci. Biotech. Biohem.59. 2303-2304 (1995)

Yutaka Kikuchi：“荧光假单胞菌 KKLlol，一种混合​​培养物中的苯甲酸降解剂，可降解联苯和多氯联苯。”

児玉徹,大竹久夫,矢木修身 編集: "地球をまもる小さな生き物たち-環境微生物とバイオレメディエーション-" 技報堂出版, 238 (1995)

儿玉彻、大竹久男、八木大隅编：“保护地球的小生物 - 环境微生物和生物修复” Gihodo Publishing，238（1995）

Yuji Nagata: "Isolation and characterization of Tns-induced mutants of Sphingomonas paucimobilis defective in 2,5-dichlorohydroguinone degration" Biosci. Biotech. Biohem.60. 689-691 (1996)

Yuji Nagata：“2,5-二氯氢醌降解缺陷的 Tns 诱导的少动鞘氨醇突变体的分离和表征”Biosci。