固体NMR法によるタンパク質の活性中心の電子構造に関する研究

利用固态NMR方法研究蛋白质活性中心的电子结构

基本信息

批准号：
07750990
负责人：
浅川直紀
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07750990/
关键词：
固体NMR ペプチド化学シフト分子軌道法

项目摘要

タンパク質の機能はその立体構造と深く関わっているため、立体構造に関する情報をどのように得るかが重要になる。生体中においてタンパク質は結晶状態にはないため、従来のX線回折法を用いて分子構造解析を行うことが困難であった。生体内において、タンパク質は細胞膜に埋め込まれた状態や結合した状態で存在する場合が少なくなく、様々な生体機能の一部を担っている。このようなタンパク質は一般に擬固体状態と考えられ、溶液状態に比べ分子運動が著しく抑制されている。本研究では、固体核磁気共鳴(NMR)法を用いてこのような擬固体状態の分子構造や電子構造に関する情報を引き出す方法を開発することを目的として、安定同位体^<13>Cラベルした数種のペプチドを合成し、L-アラニン残基中のカルボニル・α・β炭素の化学シフトテンソル主値と水素結合構造や主鎖骨格構造との相関を調べた。試料のマジックアングルスピニング(MAS)によるサイドバンド強度からα・β炭素の化学シフトテンソル主値を決定するには、数百Hz程度の安定した低速MAS回転が必要となる。しかし、この低速回転は非常に実現するのが困難であり、しかも、低速回転のため^<13>C-^<14>Nの異種核双極子カップリングによる線幅の広がりの影響が無視できないため、他の方法の開発が必務となっていた。そこで本研究では、実際のMASの回転数の1/nの回転数であたかも試料回転を行っているかのようなスピニングサイドバンドパターンを再現することができるパルスシーケンスであるeXtended Chemical Shift modulation(XCS)法を開発した。この方法により、高分解能スペクトルを保持しつつ化学シフト異方性の小さな核の化学シフトテンソル主値の決定が可能となった。このXCS法により、立体構造が既知のL-アラニン残基を含むペプチドのα炭素の化学シフトテンソル主値を決定した。その実験結果とab initio分子軌道法による磁気遮蔽定数の計算結果から、α炭素の化学シフトは主鎖の骨格構造(φ,ψ)の違いのみならず、カルボニル基やアミド基が形成する水素結合の影響を受けることがわかった。特に、水素結合の影響は、C′-C_α結合の方向から30°それた方向に主軸をもつδ_<33>に現れることがわかった。これは、各ペプチドの水素結合構造の違いがC′-C_α結合長の違いをもたらし、そのために磁気遮蔽の反磁性寄与に差が生じたためであると考えられる。

由于蛋白质的功能与它们的三维结构密切相关，因此了解如何获取有关三维结构的信息很重要。由于蛋白质在生物体中不处于结晶状态，因此很难使用常规的X射线衍射方法来分析分子结构。在体内，蛋白质通常存在于嵌入或结合细胞膜的状态中，并且负责多种生物学功能。通常认为这种蛋白质处于准固态状态，与溶液状态相比，分子运动被显着抑制。在这项研究中，为了开发一种使用固态核磁共振（NMR）来得出有关此类伪固态分子和电子结构的信息的方法，合成了几种类型的肽稳定的同位素 ^<13> C，并合成了Carbony carny-α-α-α-α-agy-agrine inder off carbory carrine carrine carrina-α-α-α-agy-α-α-ly-α-ly-n-a-n-a-n-ly-n-a-n-ly-l-agy car型含量。研究了主链主链结构。为了确定由样品的魔法角旋转（MAS）引起的α-β碳的化学位移张量的主要值，需要大约几百Hz的稳定，缓慢的MAS旋转。但是，这种缓慢的旋转极为难以实现，并且由于缓慢的旋转速度不足以忽略 ^<13> c- ^<14> n的异源核偶极偶联而导致的线宽度的效果，因此需要开发其他方法。因此，在这项研究中，我们开发了一种扩展的化学移位调制方法（XCS）方法，该方法允许旋转边带模式复制，就好像样品以实际MAS的1/N旋转速度旋转一样。这种方法使得用小型化学移动各向异性的核的化学位移张量的主要值，同时保留高分辨率频谱。该XCS方法确定了含有已知构象的L-丙氨酸残基的α-碳的主要化学移位张量值。从实验结果和使用Ab intible分子轨道方法的磁屏蔽常数计算，可以发现，α-碳的化学位移不仅受主链的骨架结构（φ，ψ）的差异的影响，而且还受到碳纤维和羰基和半基团形成的氢键。特别是，发现氢键的效应出现在Δ<33>中，Δ<33>的轴是在30°偏离C'-C_α键的方向的方向上的主要轴。这被认为是因为每种肽的氢键结构的差异导致C'-C_α键长的差异，从而导致磁性屏障的磁性贡献差异。