固体NMR法によるタンパク質の活性中心の電子構造に関する研究

利用固态NMR方法研究蛋白质活性中心的电子结构

基本信息

批准号：
07750990
负责人：
浅川直紀
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07750990/
关键词：
固体NMR ペプチド化学シフト分子軌道法

项目摘要

タンパク質の機能はその立体構造と深く関わっているため、立体構造に関する情報をどのように得るかが重要になる。生体中においてタンパク質は結晶状態にはないため、従来のX線回折法を用いて分子構造解析を行うことが困難であった。生体内において、タンパク質は細胞膜に埋め込まれた状態や結合した状態で存在する場合が少なくなく、様々な生体機能の一部を担っている。このようなタンパク質は一般に擬固体状態と考えられ、溶液状態に比べ分子運動が著しく抑制されている。本研究では、固体核磁気共鳴(NMR)法を用いてこのような擬固体状態の分子構造や電子構造に関する情報を引き出す方法を開発することを目的として、安定同位体^<13>Cラベルした数種のペプチドを合成し、L-アラニン残基中のカルボニル・α・β炭素の化学シフトテンソル主値と水素結合構造や主鎖骨格構造との相関を調べた。試料のマジックアングルスピニング(MAS)によるサイドバンド強度からα・β炭素の化学シフトテンソル主値を決定するには、数百Hz程度の安定した低速MAS回転が必要となる。しかし、この低速回転は非常に実現するのが困難であり、しかも、低速回転のため^<13>C-^<14>Nの異種核双極子カップリングによる線幅の広がりの影響が無視できないため、他の方法の開発が必務となっていた。そこで本研究では、実際のMASの回転数の1/nの回転数であたかも試料回転を行っているかのようなスピニングサイドバンドパターンを再現することができるパルスシーケンスであるeXtended Chemical Shift modulation(XCS)法を開発した。この方法により、高分解能スペクトルを保持しつつ化学シフト異方性の小さな核の化学シフトテンソル主値の決定が可能となった。このXCS法により、立体構造が既知のL-アラニン残基を含むペプチドのα炭素の化学シフトテンソル主値を決定した。その実験結果とab initio分子軌道法による磁気遮蔽定数の計算結果から、α炭素の化学シフトは主鎖の骨格構造(φ,ψ)の違いのみならず、カルボニル基やアミド基が形成する水素結合の影響を受けることがわかった。特に、水素結合の影響は、C′-C_α結合の方向から30°それた方向に主軸をもつδ_<33>に現れることがわかった。これは、各ペプチドの水素結合構造の違いがC′-C_α結合長の違いをもたらし、そのために磁気遮蔽の反磁性寄与に差が生じたためであると考えられる。

由于蛋白质的功能与其三维结构密切相关，因此了解如何获取三维结构的信息非常重要。由于蛋白质在生物体中不处于结晶状态，因此很难使用传统的 X 射线衍射方法分析其分子结构。在生物体中，蛋白质通常嵌入或结合在细胞膜上，并在各种生物功能中发挥作用。此类蛋白质通常被认为处于伪固态，与溶液状态相比，分子运动被显着抑制。在这项研究中，我们的目标是开发一种使用固态核磁共振（NMR）获取有关此类伪固态的分子和电子结构信息的方法，并且我们的目标是开发一种提取有关分子和电子结构信息的方法。我们合成了几种类型的肽，并研究了L-丙氨酸残基中羰基、α和β碳的化学位移张量主值与氢键结构和主链之间的相关性。骨架结构。为了根据样品魔角旋转（MAS）获得的边带强度确定α和β碳的化学位移张量的主值，需要约几百Hz的稳定低速MAS旋转。然而，这种低速旋转是极其难以实现的，而且由于低速旋转，^<13>C-^<14>N异核偶极子耦合导致的线宽展宽的影响也不容忽视。因此，有必要开发其他方法。因此，在这项研究中，我们开发了扩展化学位移调制（XCS），这是一种脉冲序列，可以重现旋转边带图案，就像以实际 MAS 旋转速度的 1/n 的旋转速度旋转样品一样。该方法使得可以在保持高分辨率光谱的同时确定化学位移各向异性小的核的化学位移张量的主值。通过这种 XCS 方法，我们确定了含有 L-丙氨酸残基且 3D 结构已知的肽的 α 碳的化学位移张量主值。从实验结果和从头算分子轨道法磁屏蔽常数的计算结果来看，α碳的化学位移不仅取决于主链骨架结构（φ，ψ）的差异，还决定于α碳的化学位移。还发现羰基和酰胺基形成的氢键也受到影响。特别地，发现氢键的影响出现在主轴与C'-C_α键的方向偏离30°的δ_ 33 上。这被认为是因为各肽的氢键结构的差异导致C'-C_α键长的差异，从而导致磁屏蔽的抗磁性贡献的差异。