枯草菌胞子形成期におけるDNA再編成

枯草芽孢杆菌孢子形成阶段的 DNA 重排

基本信息

批准号：
07780598
负责人：
佐藤勉
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、SpoIIIDが組換え酵素の転写とDNA再編成に独立に関与していることを明らかとするために、spoIVCAとspoIIIDのプロモーターを枯草菌で誘導可能なプロモーターであるspacプロモーターの制御下に置き、栄養増殖期で同時に発現させた際のDNA再編成の有無を調べることを目的とした。spoIVCAを栄養増殖期に強制発現させ、DNA再編成の有無をみたところ、栄養増殖期ではDNA再編成は検出されず胞子形成期(T_3)に検出された。また、spoIIID変異株では、spoIVCAを強制発現させても胞子形成期にDNA再編成は検出されなかった。この結果から、SpoIIIDはDNA再編成に直接関与することが強く示唆された。spoIVCAとspoIIIDの同時発現系による証明は、現在おこなっている。次に、SpoIIIDが結合する遺伝子を探索をおこなった。SpoIIIDのC末端側に6個のヒスチジンが付加されたSpoIIID-hisをNi^<2+>-NTA(nitrilo-triacetic acid)アガロースに結合させ、枯草菌染色体DNAをを制限酵素により断片化し、このカラムに吸着させた。SpoIIID-hisに結合するDNA断片をイミダゾール濃度勾配により溶出し、このDNA断片を大腸菌のプラスミドベクターにクローン化し、その塩基配列を決定した。この結果、この中にはプリンおよびピリミジン合成系の遺伝子が存在し、これらの構造遺伝子内にSpoIIIDが結合することが明らかとなった。この結果から、SpoIIIDは、spoIVCAなどの胞子形成期に働く遺伝子を正または負に、また栄養増殖期に必要な遺伝子の発現を抑制している可能性が示唆された。

在本研究中，为了阐明SpoIIID独立参与重组酶转录和DNA重排，我们将spoIVCA和spoIIID的启动子置于枯草芽孢杆菌中的诱导型启动子spac启动子的控制下。研究在营养生长期同时表达时是否存在 DNA 重排。当我们在营养生长期强制表达spoIVCA并检查是否存在DNA重排时，在营养生长期未检测到DNA重排，但在孢子形成期（T_3）检测到DNA重排。此外，在spoIIID突变株中，即使强制表达spoIVCA，在孢子形成阶段也没有检测到DNA重排。这些结果强烈表明 SpoIIID 直接参与 DNA 重排。目前正在进行使用 spoIVCA 和 spoIIID 共表达系统的证明。接下来，我们寻找 SpoIIID 结合的基因。在SpoIIID的C末端添加了6个组氨酸的SpoIIID-his与Ni^2+-NTA(次氮基三乙酸)琼脂糖结合，并用限制酶将枯草芽孢杆菌染色体DNA片段化。到列上。使用咪唑浓度梯度洗脱与SpoIIID-his结合的DNA片段，将该DNA片段克隆到大肠杆菌质粒载体中，并确定其核苷酸序列。结果表明，该蛋白质中存在嘌呤和嘧啶合成系统的基因，并且SpoIIID与这些结构基因结合。这些结果表明，SpoIIID可能正向或负向抑制在孢子形成阶段发挥作用的基因（例如spoIVCA）的表达，并抑制营养生长阶段必需的基因的表达。