λファージCro蛋白質の2量体間S-S結合架橋変異体の立体構造解析

λ噬菌体Cro蛋白二聚体S-S键交联突变体的三维结构分析

基本信息

批准号：
07780574
负责人：
白川昌宏
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780574/
关键词：
リプレッサー DNA結合蛋白質 NMR 蛋白工学

项目摘要

大腸菌バクテリオファージλ初期オペロンの遺伝子転写制御蛋白質であるCro蛋白質のVal55をCysに換えた点突然変異体の核磁気共鳴法(NMR)による構造解析を行った。このCroV55C変異体は(1)Cro蛋白質2量体の2つのサブユニット間にCys間のS-S結合が形成され、2つのサブユニットが架橋されていること、(2)野生型と比べて大きく熱安定化していること、(3)特異的DNA配列への結合能が数分の一に減少していること、などの性質を持つ。このCroV55C変異体についてCBCA(CO)NH,CBCANH,HNCO,HN(CA)CO,C(CO)NH,HBHA(CBCACO)NHなどの3重共鳴3次元NMRスペクトルの測定を行い、主鎖、側鎖のほぼ全ての^1H,^<15>N,^<13>C核の帰属を行った。またその過程で、蛋白質の^<15>N,^<13>C,^2Hによる同位体ラベルも行い、重水素ラベルと重水素デカップリングを利用してHN(CA)NH実験に大きな改良を施すことに成功した。この手法は分子量の大きな蛋白質の主鎖のシグナルの帰属に大変有用であると期待される。λCro蛋白質野生型のNMRシグナルの帰属は既に完了しているので、化学シフト値の比較をすることによって立体構造の差異を見積もったところ、野生型、V55C変異体間に立体構造の差異は殆ど無いことが示された。従って、サブユニット間のS-S結合は立体構造を換えないことが判った。

我们使用核磁共振（NMR）对点突变体进行了结构分析，其中Cro蛋白（大肠杆菌噬菌体λ早期操纵子的基因转录控制蛋白）的Val55被Cys取代。该CroV55C突变体表现出（1）Cro蛋白二聚体的两个亚基之间形成了Cys之间的S-S键，并且两个亚基发生交联；（3）与特定DNA序列的结合能力降低到了一小部分。它是什么。对于该 CroV55C 突变体，测量了三重共振 3D NMR 谱，例如 CBCA(CO)NH,CBCANH,HNCO,HN(CA)CO,C(CO)NH,HBHA(CBCACO)NH 几乎所有 ^1H,^<15。 >N，^ 13 C链的核被指定。在此过程中，我们还用^15N、^13C、^2H对蛋白质进行了同位素标记，并通过使用氘标记和氘去耦极大地改进了HN(CA)NH实验。该方法预计对于归因大分子量蛋白质主链的信号非常有用。由于野生型λCro蛋白的NMR信号分配已经完成，我们通过比较化学位移值来估计3D结构的差异，发现野生型和V55C突变体之间的3D结构几乎没有差异。结果表明因此，发现亚基之间的S-S键不会改变三维结构。