ミトコンドリア遺伝子異常症における体細胞モザイシズムの形成機構の解析

线粒体遗传病体细胞嵌合形成机制分析

• 批准号: 06770584
• 负责人: 小林 葉子
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770584/
• 关键词: ミトコンドリア異常症; ミトコンドリアDNA; Leber病; PCR

ミトコンドリア異常症では1人の患者で変異遺伝子がヘテロプラスミ-に存在し、その割合が症状発現の重要な因子である。1細胞での変異遺伝子の量及び分布を知ることは、変異遺伝子量と細胞障害性の発現との関連、さらに分配形式を知る上で重要である。今年度、細胞ごとの遺伝子型を解析する方法を検討し、変異遺伝子の細胞レベルでの分布を明らかにした。11778変異をもつLeber病大家系の2人の白血球より抽出したDNA(変異遺伝子の割合はそれぞれ80%と50%)を1μgから0.1pgまで段階希釈し、2段階のPCR法(25cycle×2)にて変異遺伝子を含むDNA断片を増幅、制限酵素で切断後アガロースゲル電気泳動後解析した。1μgから1pgまでは、バンドが認められ、変異遺伝子の割合はそれぞれの患者につき全サンプルで同じであった。このことは1細胞のmtDNAを解析することが可能である。また少ないコピー数を2段階PCR法で増幅してもアーチファクトが生じないことを示している。血液より分離した白血球は十分に希釈し、培養皿に移した後上澄みを取り替え洗浄し、micromanipulation法にて1細胞ごとに分離した。この方法により細胞浮遊中のDNA混入をなくすることが出来た。80%の割合で変異を認めるLeber病の患者の白血球25細胞を解析した。16細胞は変異mtDNAのみ、5細胞は正常mtDNAのみで、21/25は細胞内ホモプラスミ-を示した。Leber病の白血球では、細胞分裂に伴い2種類のmtDNAは一方のmtDNAをもつように両方向性分配されていくと考えられた。これはこの変異の白血球における細胞障害性が強くないからかもしれない。この結果は細胞分裂の頻度や1細胞あたりのmtDNAコピー数が個となる他の組織、あるいは他のミトコンドリア異常症では異なるものと考えられる。今後、この方法を培養細胞系に応用し、細胞内の2種類のmtDNAの動きやそれに影響を及ぼす因子について検討する予定である。

在线粒体疾病中，突变基因存在于每个患者的异质性中，其比例是症状表现的重要因素。了解突变基因在一个细胞中的数量和分布对于理解突变基因的数量与细胞毒性表达之间的关系以及分布模式非常重要。今年，我们研究了分析每个细胞基因型的方法，并阐明了突变基因在细胞水平上的分布。从具有 11778 突变的莱伯病大家族的两名成员（突变基因百分比分别为 80% 和 50%）的白细胞中提取 DNA，将其从 1 μg 连续稀释至 0.1 pg，并采用两步 PCR 方法（进行25个循环×2)扩增含有突变基因的DNA片段，用限制性酶切割，并在琼脂糖凝胶电泳后进行分析。从1μg到1pg，观察到条带，每个患者的所有样本中突变基因的比例是相同的。这使得分析单个细胞的线粒体DNA成为可能。它还表明，即使通过两步 PCR 扩增少量拷贝，也不会出现伪影。将从血液中分离的白细胞充分稀释，转移至培养皿中，更换上清液并洗涤，通过显微操作分离各细胞。这种方法可以消除细胞悬浮液中的 DNA 污染。我们分析了莱伯氏病患者的 25 个白细胞，80% 的病例存在突变。 16个细胞仅含有突变mtDNA，5个细胞仅含有正常mtDNA，21/25显示细胞内同质性。在莱伯病白细胞中，两种类型的线粒体DNA被认为是双向分布的，因此当细胞分裂时存在一种类型的线粒体DNA。这可能是因为这种突变在白细胞中不具有很强的细胞毒性。在细胞分裂频率或每个细胞的线粒体 DNA 拷贝数不同的其他组织中，或在其他线粒体疾病中，该结果可能有所不同。未来，我们计划将这种方法应用于培养细胞系统，研究细胞内两种线粒体DNA的运动以及影响它们的因素。