ラット肝培養伊東細胞のヒアルロン酸合成に及ぼすエタノールとその代謝産物の影響

乙醇及其代谢物对培养大鼠肝Ito细胞透明质酸合成的影响

• 批准号: 06770407
• 负责人: 浦島 左千夫
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kanazawa Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770407/
• 关键词: アルコール性肝障害; ヒアルロン酸; 伊東細胞

アルコール(AL)性肝障害では、血中ヒアルロン酸(HY)値が高値を示す例が少なくないが、その機序として類洞内皮細胞でのHYの分解能の低下、ないしはFat storing cell(FSC)によるHYの合成亢進の可能性が考えられる。そこで、正常および慢性AL投与ラット肝より分離・培養したFSCのHY合成能について検討することとした。1.FSCの分離・培養・正常および慢性AL投与Wistar系雄性ラットからTsutsumiらの方法に従ってFSCを分離・培養した。すなわち、ラット肝をプロナーゼとコラゲナーゼで潅流後、メトリザマイドを用いた比重遠心法により、FSCを分離・採取し、Dulbecco's MEMを用い、37℃、5%炭酸ガス下で培養した。なお、培養FSCの同定はデスミン染色によって確認した。伊東細胞は培養開始3日目より細胞数が増加し始め、9日目以降は定常状態を示した。2.HY濃度の測定:HY結合蛋白(HABP)を用いたSandwich Binding Protein Assay(SBPA)法により測定した。すなわち、ポリスチレンビーズ上に固相化したHABPと回収した培養液とを反応させた後、ビオチン化HABPを加え、さらにペルオキシダーゼ標識化アビジンを結合させ、o-phenylene-diamineを加えて発色後、492nmにおける吸光度を測定し、標準曲線からHY濃度を測定した。なお、FCS加Dulbecco's MEMに含まれているHY濃度を測定し、検体の濃度を補正した。3.正常ラット肝由来培養FSCにおけるHY合成能:FSCの増殖にともなうHYの経時的推移についてみると、培養3日目 254±54mg/dl、5日目 846±43mg/dl、9日目 1026±86mg/dおよび、12日目 1580±120mg/dlであった。これらの結果から、SABP法によるHYの測定は培養3日目から可能であり、またFSCの増殖とともに、HY産生の増加することが明らかとなった。4.慢性AL投与ラット肝由来培養FSCにおけるHY合成能:培養3と5日目のHY濃度は、287±78mg/dl、912±122mg/dlであり、いずれも対応する正常ラットのHY濃度より高い傾向を示し、培養9日目では1500mg/dl以上、培養120日目では2000mg/dl以上で、正常ラットより明らかに高い値であった。これらの実験結果から、慢性AL投与が培養FSCのHY合成能を促進することが推定された。

在酒精（AL）引起的肝损伤中，很多情况下血液中的透明质酸（HY）水平较高，但其机制是肝窦内皮细胞或脂肪储存细胞（FSC）中HY的分解能力下降。 ) 可能因此增强了 HY 的合成。因此，我们决定研究从正常和慢性 AL 处理的大鼠肝脏中分离和培养的 FSC 的 HY 合成能力。 1. FSCs的分离培养：按照Tsutsumi等的方法从正常和慢性AL处理的雄性Wistar大鼠中分离培养FSCs。即，用链霉蛋白酶和胶原酶灌注大鼠肝脏后，使用甲曲酰胺通过比重离心分离并收集FSC，并在37℃、5％二氧化碳气体下在Dulbecco's MEM中培养。通过结蛋白染色确认培养的 FSC 的身份。 Ito细胞数量在培养第3天开始增加，第9天开始达到稳定状态。 2.HY浓度的测定：使用HY结合蛋白(HABP)通过夹心结合蛋白测定(SBPA)法测定。即，使固定在聚苯乙烯珠上的HABP与回收的培养液反应后，添加生物素化的HABP，进一步结合过氧化物酶标记的抗生物素蛋白，添加邻苯二胺，显色，在492nm处显色。测量35℃的吸光度，并从标准曲线确定HY浓度。测定添加了FCS的Dulbecco's MEM中所含的HY浓度，并校正样品的浓度。 3. 正常大鼠肝脏培养的 FSC 中 HY 合成能力：观察 FSC 增殖时 HY 的时间过程：培养第 3 天为 254 ± 54 mg/dl，第 5 天为 846 ± 43 mg/dl，以及培养第 9 天为 1026 ±86mg/d，第 12 天为 1580±120mg/dl。这些结果表明，从培养的第三天开始，使用 SABP 方法进行 HY 测量是可能的，并且 HY 产量随着 FSC 增殖而增加。 4. 慢性 AL 处理大鼠肝脏培养 FSC 的 HY 合成能力：培养第 3 天和第 5 天的 HY 浓度分别为 287 ± 78 mg/dl 和 912 ± 122 mg/dl，均高于相应的正常大鼠的HY浓度呈现较高的趋势，培养第9天的值超过1500mg/dl，培养第120天的值超过2000mg/dl，明显高于对照组。正常老鼠。根据这些实验结果，估计长期给予AL可促进培养的FSC的HY合成能力。