PCR法を用いたDNA塩基配列比較によるキンウワバ類の類猿関係解析法の開発

开发通过PCR法比较DNA碱基序列来分析棘科类人猿与单形关系的方法

• 批准号: 06760046
• 负责人: 野村 昌史
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06760046/
• 关键词: キンウワバ類; DNA; PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法; Proteinase K; プライマー; チトクロームオキシダーゼII

遺伝子本体であるDNAのうち、ある特定の遺伝子をコードしている部分をPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法を用いて増幅させ、この部位の塩基配列を読みとり種間での比較からキンウワバの類猿関係を明らかにすることを目的とした。まず研究上の基礎的な条件設定を決定することとし、成虫の脚1本を用いてProteinase KによりDNAの抽出を行った。抽出したDNAに遺伝子をコードしている部分のプライマーを反応させて増幅を行うこととなるが、当初予定したDNAのデータベースを利用する方法は利用するのにあたり設備等が必要であったため、研究討議なども参考にしてこれまでに公表されている論文から増幅させる部位を決定した。その結果ミトコンドリアDNA上にコードされている遺伝子の方が、DNAの抽出条件にあまり左右されず安定して遺伝し部位の増幅が行えるようであったため、チトクロームオキシダーゼII(COII)を選定し、蛾で報告されているこの遺伝子の両端部分のプライマーを合成し、増幅を試みた。その結果、一般に行われているPCRの温度および試薬条件でCOIIと思われる断片長(約600塩基対)の増幅がアガロース電気泳動により確認されたが、安定して増幅されなかったため反応時の試薬などの条件の検討を行った。これによりほぼ安定した増幅が行えるようになったが、使用したプライマーに非特異的な部位の増幅に由来する断片が現れ、この存在により塩基配列の比較を行うことはできなかった。今後は目的とするCOII-DNA断片のみを増幅させる条件と検討と、増幅後速やかに塩基配列を行うことができる質の良い断片を得る条件の検討を行う予定である。

使用PCR（聚合酶链式反应）扩增编码特定基因的DNA部分，读取该部分的核苷酸序列并在物种之间进行比较，目的是澄清。首先，我们确定了基础研究条件，并使用成年昆虫的一条腿使用蛋白酶 K 提取了 DNA。扩增是通过将提取的DNA与基因编码部分的引物反应来进行的，但原本计划的使用DNA数据库的方法需要设备，因此进行了研究讨论，根据之前发表的论文确定了要扩增的位点。 ，参考以下内容。结果，线粒体DNA上编码的基因似乎更稳定，并且受DNA提取条件的影响较小，允许位点扩增，因此我们选择细胞色素氧化酶II（COII），并为该基因的两端合成了引物并尝试扩增。结果，在常用的 PCR 温度和试剂条件下，通过琼脂糖电泳证实了被认为是 COII 的片段长度（约 600 个碱基对）的扩增，我们检查了以下条件：虽然这使得可以进行几乎稳定的扩增，但是来自非特异性位点扩增的片段出现在所使用的引物中，并且这些片段的存在使得无法比较碱基序列。未来，我们计划研究仅扩增目标COII-DNA片段的条件以及获得扩增后可立即测序的高质量片段的条件。