遺伝子ターゲッティング法を用いた紫外線高感感受性修復欠損マウス系統の樹立

基因打靶法建立紫外线敏感修复缺陷小鼠品系

基本信息

批准号：
06780707
负责人：
原田良信
金额：
$ 0.7万
依托单位：
National Institute of Radiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780707/
关键词：
マウスターゲッティング色素性乾皮症 XP ERCC5 紫外線ノックアウト

项目摘要

前年度までの研究によりヒト色素性乾皮症G群原因遺伝子XPGのマウスホモログであるxpgのcDNAおよびゲノミックDNAをクローニングした。マウスゲノミックDNAからそれぞれ異なったエクソンを不活性化する3種類(TV1,TV2,TV3)のターゲッティングベクターを作製した。これらのベクターをマウスES細胞(D3)にトランスフェクションし、G418とGANCでセレクションを行った。TV2を用いた実験では、7.5×10^6のES細胞から200の418′GANC′コロニーを得た。PCR法を用いた実験により、これらのうち13.3%が相同組み換え体であることが判明した。さらに5つのコロニーについてサザン法を用いた実験を行ったところ、5つ全てが相同組み換え体であると確認された。同様にTV3を用いた実験では7.5×10^6のES細胞から380のG418′GANC′コロニーを得、PCR法により、これらのうち24.0%が相同組み換え体であることが判明し、さらに32個のコロニーについてサザン法を用いた茂を行ったところ、32個全てが相同組み換え体であると確認された。TV1を用いた実験においては相同組み換え体と思われるコロニーは得られなかった。TV2およびTV3の実験から得られた相同組み換え体と確認されたES細胞の中から、染色体数や形態が正常であると思われるクローンを選び、C57BL/6の初期胚にマイクロインジェクション法を用いて導入したところ、キメラマウスが誕生した。今後これらのキメラマウスから紫外線高感受性しゅうふく欠損マウス系統を樹立する予定である。

通过截至前一年的研究，我们克隆了负责人色素性干皮病G群基因XPG的小鼠同源物xpg的cDNA和基因组DNA。我们创建了三种类型的靶向载体（TV1、TV2、TV3），它们可以灭活小鼠基因组 DNA 的不同外显子。将这些载体转染至小鼠 ES 细胞 (D3) 中，并使用 G418 和 GANC 进行选择。在使用TV2的实验中，从7.5×10^6 ES细胞中获得了200 418'GANC'集落。使用PCR方法的实验表明，其中13.3%是同源重组体。此外，当对5个菌落进行使用Southern法的实验时，确认所有5个菌落都是同源重组体。类似地，在使用TV3的实验中，从7.5×10^6 ES细胞中获得了380个G418'GANC'集落，PCR显示其中24.0%是同源重组体，另外32个集落使用Southern方法进行分析时，所有32个菌落均被确认为同源重组体。在使用TV1的实验中，没有获得看起来是同源重组体的集落。在TV2和TV3实验中确认为同源重组体的ES细胞中，选择看起来具有正常染色体数目和形态的克隆并将其显微注射到早期C57BL/6胚胎中，当引入时，嵌合小鼠诞生。未来，我们计划从这些嵌合小鼠中建立具有高紫外线敏感性的小鼠品系。