RT-PCR法によるネフローゼ自然発症マウス腎糸球体内の遺伝子発現の解析

RT-PCR法分析自发性肾病小鼠肾小球基因表达

基本信息

批准号：
06780700
负责人：
岡本宗裕
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780700/
关键词：
自然発症腎炎モデルマウスネフローゼマウス ICGN RT-PCR 遺伝子発現腎糸球体

项目摘要

ICGNマウスは、近年見いだされたネフローゼ症候群を伴う糸球体腎炎を自然発症するマウスで、末期には重度の糸球体硬化症に陥る。一般に、腎における血漿蛋白の濾過障壁は、腎糸球体基底膜であると考えられている。糸球体基底膜は、IV型コラーゲンによる基本骨格に、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなどが結合したものである。また、糸球体硬化症の発症および進行には、TGF-βおよびPDGFが深く関与すると考えられている。従って、ICGNマウスではこれらの構成成分の遺伝子発現に何らかの異常があると考えられる。そこで、本研究では、蛋白濾出および糸球体硬化症の発症機序を分子遺伝学的に明らかにするため、糸球体局所でのこれらの遺伝子の発現を解析する。糸球体局所で遺伝子発現を調べるためには、糸球体を単離する必要があったため、マイクロディセクション法による腎糸球体単離の方法を確立した。つぎに、30個の糸球体から全RNAを抽出し、RT反応を行う系を確立した。IV型コラーゲンα鎖、ラミニン、TGF-βおよびRT-RCRにおいて定量的分析を行う際のコントロールとして使用するベータアクチンについて、それぞれ1セットのプライマーを合成した。これらのプライマーと糸球体から調整したcDNAを用いてPCRを行い、単一のDNA断片が合成される条件を決定した。さらに、PCR産物のデンシトメトリーによる定量法を確立した。これにより、RT-RCRによる腎糸球体局所での遺伝子発現を定量とすることが可能となった。この方法で、生後3週目のICGNマウスとICRマウスの腎糸球体におけるIV型コラーゲンα鎖のmRNA量を比較したところ、発現量はICGNマウスのほうが有為に増加していた。現在、他の遺伝子についておよびそれらの経時的変化について検討中である。

ICGN小鼠是近年来发现的伴有肾病综合征的自发性肾小球肾炎的小鼠，在晚期发展为严重的肾小球硬化症。一般认为，肾脏中血浆蛋白的滤过屏障是肾小球基底膜。肾小球基底膜由IV型胶原蛋白的基本骨架与层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、巢蛋白等物质结合而成。此外，TGF-β和PDGF被认为与肾小球硬化症的发生和进展密切相关。因此，认为ICGN小鼠体内这些成分的基因表达存在某种异常。因此，在本研究中，我们将分析这些基因在肾小球局部的表达，以阐明蛋白质过滤和肾小球硬化发病的分子遗传机制。为了检查肾小球局部基因表达，有必要分离肾小球，因此我们建立了一种利用显微解剖分离肾小球的方法。接下来，我们从30个肾小球中提取总RNA并建立了RT反应系统。分别针对 IV 型胶原 α 链、层粘连蛋白、TGF-β 和 β-肌动蛋白合成一组引物，以在 RT-RCR 中进行定量分析时用作对照。使用这些引物和从肾小球制备的cDNA进行PCR以确定合成单个DNA片段的条件。此外，我们建立了一种通过光密度测定法定量 PCR 产物的方法。这使得使用 RT-RCR 量化肾小球局部基因表达成为可能。利用该方法，我们比较了3周龄ICGN小鼠和ICR小鼠肾小球中IV型胶原α链的mRNA水平，发现ICGN小鼠中表达水平显着升高。目前正在研究其他基因及其随时间的变化。