ヒト血小板及びラット唾液腺の分泌を調節する低分子量GTP結合蛋白質に関する研究

调节人血小板和大鼠唾液腺分泌的低分子量 GTP 结合蛋白的研究

基本信息

批准号：
06780500
负责人：
永田浩一
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.血小板のモデル細胞系としてホルボールエステルにより分化誘導させたヒト巨核球系培養細胞MEG-01を用いて、各種G蛋白質などシグナル分子の分化誘導に伴う変動・分泌応答への関与について検討した。1)PMA処理により分化させたMEG-01細胞を用いてトロンビン刺激し、血小板α顆粒内蛋白質であるβ-トロンボグロブリンの産生・分泌を調べたが、著明な分泌亢進は認められなかった。2)MEG-01細胞は、三量体型G蛋白質、Gs,Gi_2,Gi_3,Gz,G_<11>G_<12>のαサブユニットおよびβサブユニットが蛋白質レベルで検出された。MEG-01細胞のPMAによる分化誘導により、三量体型G蛋白質のGi_2α,Gi_3αおよびGβが日のオーダーで漸増したが、他のものはほとんど変化しなかった。一方、低分子量G蛋白質のRac2は、PMA処理後30分から著明に増加した。3)PMA処理したMEG-01細胞から出現する血小板様顆粒を収集し、その低分子量G蛋白質のmRNAおよび蛋白質レベルでの発現を検討した。rap1A,rap1B,rap2B,ralA,rhoA,rac1,rac2,CDC42Hs,rab1,rab3B,rab4,rab6,ramおよびranについてRT-PCRを行ったところ、rab4以外のすべてのDNAの増幅を認めた。また、Rap1,RhoA,Rac,CDC42,Rab6,Rab8について蛋白質レベルでの発現が確認された。4)MEG-01細胞においてPKC-γ以外のPKCα,-βI,-βII,-δ,-ε,-η,-θおよび-ζの発現を認めたが、顆粒中にはPKC-γおよび-ζタイプが検出されなかった。蛋白質レベルで血小板に検出されるサブタイプはPKCα,-βI,-βIIおよび-ζであるが、顆粒中には量的に少ないがいずれも発現していた。MEG-01細胞では、上記4種に加えてPKC-εおよび-θが検出された。2.ラット唾液腺細胞の細胞分画により低分子量型Rap1pが顆粒膜に、三量体型G蛋白質Gtは形質膜に局在することが明らかとなった。

1. 以佛波酯诱导分化的培养人巨核细胞系 MEG-01 作为血小板模型细胞系，研究了各种 G 蛋白等信号分子在分化诱导相关变化和分泌反应中的参与情况. 1)用凝血酶刺激经PMA处理分化的MEG-01细胞，研究血小板α的颗粒内蛋白β-血栓球蛋白的产生和分泌，但没有观察到明显的分泌。 2)在MEG-01细胞中，在蛋白水平检测到三聚体G蛋白的α和β亚基Gs、Gi_2、Gi_3、Gz、G_11G_12>。当MEG-01细胞被PMA诱导分化时，三聚体G蛋白Gi_2α、Gi_3α和Gβ在数天内逐渐增加，但其他蛋白几乎保持不变。另一方面，低分子量G蛋白Rac2在PMA处理30分钟后显着增加。 3)收集PMA处理的MEG-01细胞中出现的血小板样颗粒，并检查低分子量G蛋白在mRNA和蛋白水平上的表达。当对 rap1A、rap1B、rap2B、ralA、rhoA、rac1、rac2、CDC42Hs、rab1、rab3B、rab4、rab6、ram 和 ran 进行 RT-PCR 时，观察到除 rab4 之外的所有 DNA 的扩增。此外，还确认了Rap1、RhoA、Rac、CDC42、Rab6和Rab8在蛋白质水平上的表达。 4) MEG-01细胞中观察到PKC-γ以外的PKCα、-βI、-βII、-δ、-ε、-η、-θ和-ζ表达，但未检测到PKC-γ和-ze型。在血小板中检测到的蛋白水平亚型为PKCα、-βI、-βII和-ζ，并且均以颗粒形式表达，但量很少。除上述四种类型外，MEG-01细胞中还检测到PKC-ε和-θ。 2.大鼠唾液腺细胞的细胞分级显示，低分子量Rap1p定位于颗粒膜，三聚体G蛋白Gt定位于质膜。