Secretory Component遺伝子発現調節機構の解析

分泌成分基因表达调控机制分析

基本信息

批准号：
06771610
负责人：
竹之内信子
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Nihon University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06771610/
关键词：
Secretory component Subtruction IFN-γ Gene expression

项目摘要

Secretory component(SC)は消化管や口腔内における局所免疫機構に重要な役割を果たす、上皮細胞から産生される蛋白質である。しかしながらその発現制御機構は明らかではない。近年、SCがサイトカイン刺激により転写レベルで発現量が増加することが明らかとなった。そこでその詳細なメカニズムを解析するための一端として、ヒト大腸癌由来細胞株HT-29をIFN-γ刺激したときに誘導されるmRNAのcDNAクローニングを試みた。HT-29細胞を100n/ml IFN-γで48時間刺激したもの、未処理のものからそれぞれmRNAを精製し、IFN-γで刺激したものからfirst strand cDNAを合成した。一方、未処理細胞由来のmRNAはphotobiotin化し、first strand cDNAと68度で48時間hybridizeした。Hybridizeした後avisin-biotin complexを形成させ、phenol/chloroform抽出することでhybridizeした核酸を除去した。このようにして得られた一本鎖cDNAはHT-29細胞をIFN-γで刺激した時に特異的に発現したmRNAのcDNA(subtracted cDNA)である。通常は核酸のラベルを^<32>P-dCTPを用い、ハイドロキシアパタイトカラムにより一本鎖cDNAを分離するが、核酸をphotobiotin化しavisin-biotin complexをphenol/chloroform抽出する方法では、ラベルの容易さに加え、一本鎖DNAを容易に分離することができた。更に、HT-29をIFN-γで刺激したときのcDNAから作製したcDNAライブラリーを作製し、subtructed cDNAをラベルし、スクリーニングを進めている。

分泌成分（SC）是由上皮细胞产生的蛋白质，在胃肠道和口腔的局部免疫系统中发挥重要作用。但其表达控制机制尚不清楚。近年来，已经清楚SC的表达水平在细胞因子刺激下在转录水平上增加。因此，作为详细机制分析的一部分，我们尝试对人结肠癌来源的细胞系HT-29用IFN-γ刺激时诱导的mRNA进行cDNA克隆。从用100n/ml IFN-γ刺激48小时的HT-29细胞和未处理的细胞中纯化mRNA，并从用IFN-γ刺激的细胞合成第一链cDNA。另一方面，来自未处理细胞的mRNA被光生物素化并与第一链cDNA在68度下杂交48小时。杂交后，形成亲和素-生物素复合物，并通过苯酚/氯仿提取除去杂交的核酸。由此获得的单链cDNA是当用IFN-γ刺激HT-29细胞时特异性表达的mRNA的cDNA(减去的cDNA)。通常，使用32P-dCTP来标记核酸，并使用羟基磷灰石柱分离单链cDNA。此外，可以容易地分离单链DNA。此外，我们正在构建由用IFN-γ刺激HT-29时获得的cDNA制成的cDNA文库，标记消减的cDNA，并进行筛选。