酵母のDNA複製開始にたずさわる因子Dna1の機能の解析

酵母 DNA 复制起始因子 Dna1 的功能分析

• 批准号: 05780501
• 负责人: 川崎 泰生
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05780501/
• 关键词: DNA複製; DNA1; RPA135; RNAポリメラーゼI; G1; S期

酵母のDNA複製開始に関与していると考えられるDNA1遺伝子のクローニングと塩基配列決定を最初に行った。高温感受性dna1変異を持つ株に、ARS1およびCENを持つシャトルベクターYCp50に酵母ゲノムの10-15kbp断片を持つライブラリーを形質転換し、36度でコロニーを形成するものを分離した。これは以前に報告されていたとおり第16番染色体上にあたることがわかった。また、ノーザン法によってこの断片とハイブリッドを形成するRNAを調べたところ、5-6kbのmRNAがあることがわかった。しかも、この転写産物は量的には非常に少ないものであった。また、いくつかの制限酵素で断片化、pUCベクターにサブクローニングして塩基配列を決定し、ホモロジー検索を行なうと、RPA135という遺伝子そのものであることがわかった。この遺伝子は、rRNAの転写を行なうRNAポリメラーゼIのsecond largest subunitをコードする遺伝子であり、第16番染色体上にあることもわかっていた。RPA135遺伝子を組み込んだプラスミドを、dna1変異株に形質転換し温度感受性を調べたところ、RPA135がdna1変異を相補するので、DNA1はRPA135そのものであると確認できた。一方、RPA135を欠失させた株は生育できないが、この株にGALプロモーター支配下でrRNAを発現させることができるプラスミドを導入すると、ガラクトース入り培地上で生育可能となる。このプラスミドをdna1変異株に導入したところ、36度でもガラクトース入り培地上で生育可能となったので、RPA135が直接DNA複製に関与している可能性は低いと考えられ、Dna1(Rpa135)はrRNAの発現を介して間接的に細胞がS期(DNA合成期)に入ることを助けていると考えられる。いままでにこのような報告はなかったので、G1/S期での細胞周期調節に翻訳調節が関与している可能性が考えられる。

我们首先克隆并测序了 DNA1 基因，该基因被认为与酵母中 DNA 复制的启动有关。将具有高温敏感DNA1突变的菌株用含有酵母基因组10-15kbp片段的文库转化至含有ARS1和CEN的穿梭载体YCp50中，并分离出在36度下形成菌落的菌株。正如之前报道的那样，它被发现位于 16 号染色体上。另外，当我们用Northern方法检查与该片段杂交的RNA时，我们发现有一个5-6 kb的mRNA。而且，该转录产物的数量非常小。此外，通过用几种限制性酶将其片段化，将其亚克隆到pUC载体中，确定其核苷酸序列，并进行同源性搜索，发现它是基因RPA135本身。该基因编码 RNA 聚合酶 I 的第二大亚基，可转录 rRNA，并且也位于 16 号染色体上。将含有RPA135基因的质粒转化到dna1突变株中，并检查其温度敏感性，由于RPA135与dna1突变互补，因此证实DNA1就是RPA135本身。另一方面，RPA135被删除的菌株不能生长，但是如果将能够在GAL启动子控制下表达rRNA的质粒导入到该菌株中，则可以在含有半乳糖的培养基上生长。当将该质粒引入dna1突变株时，即使在36摄氏度下，它也能在含有半乳糖的培养基上生长，因此RPA135似乎不太可能直接参与DNA复制，并且Dna1（Rpa135）是一种rRNA。人们认为它通过 的表达间接帮助细胞进入S期（DNA合成期）。由于迄今为止还没有此类报道，因此翻译调控可能参与了G1/S期的细胞周期调控。