In situハイブリダイゼーション法による肥大軟骨細胞の機能発現の解析

原位杂交法分析肥大软骨细胞的功能表达

基本信息

批准号：
05771490
负责人：
横瀬敏志
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Showa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05771490/
关键词：
軟骨内骨化肥大軟骨細胞基質蛋白 in situハイブリダイゼーション

项目摘要

軟骨内骨化のメカニズムを探る目的で、ラット肥大軟骨細胞における基質蛋白遺伝子の発現をin situハイブリダイゼーション法を用いて調べた。1)材料と方法:正常ラット(8週令)及び下垂体除去ラットの下顎頭と大腿骨を用いて脱灰組織のパラフィン切片を作成しin situハイブリダイゼーション法と免疫組織化学染色を行った。プローブはラット由来のType Iコラーゲン、オステオカルシン、オステオポンチン、マトリックスGIa蛋白のcDNAからDIGを用いて標識した非放射性RNAプローブを用いた。免疫組織化学では、ラットのType Iコラーゲンとオステオカルシンに対するポリクローナル抗体を用いた。2)結果:正常ラットにおける肥大軟骨細胞ではオステオポンチンとマトリックスGIa蛋白の遺伝子発現が見られた。Type Iコラーゲンとオステオカルシンは一次海面骨の骨芽細胞に遺伝子および蛋白の発現が見られたが、肥大軟骨細胞には見られなかった。下垂体除去ラットの肥大軟骨細胞でのオステオポンチンとマトリックスGIa蛋白の遺伝子の発現は正常ラットのものに比べて著しい減弱を示した。3)考察:軟骨内骨化に重要な役割を果たしていると考えられる肥大軟骨細胞に、オステオポンチンとマトリックスGIa蛋白が遺伝子レベルで発現されており、さらに骨格の成長に著しい影響を与える下垂体除去ラットの肥大軟骨細胞では、これらの基質蛋白の遺伝子発現が減弱していることが確認された。これらの所見よりオステオポンチンとマトリックスGIa蛋白は軟骨内骨化と密接に関連した蛋白であることが示唆された(現在投稿準備中)。ラット軟骨のプロテオグリカンのコア蛋白とType XコラーゲンのcDNAより作成したプローブを用いて肥大骨軟骨細胞のものに機能変化を現在検討中である。

为了探索内软骨骨化的机制，使用原位杂交研究了底物蛋白基因在大鼠肥大软骨细胞中的表达。 1）材料和方法：使用正常大鼠（8周大）和垂体去除大鼠制备脱矿体组织的石蜡切片，进行原位杂交和免疫组织化学染色。该探针是一种非放射性RNA探针，该探针在I型胶原蛋白，骨钙蛋白，骨桥蛋白和基质GIA蛋白的大鼠cDNA上挖了。免疫组织化学使用了针对大鼠I型胶原蛋白和骨钙素的多克隆抗体。 2）结果：在正常大鼠的肥厚软骨细胞中观察到骨桥蛋白和基质gia蛋白的基因表达。 I型胶原蛋白和骨钙素在原发性海面骨中的成骨细胞中显示出基因和蛋白质表达，但在肥厚的软骨细胞中却没有。与正常大鼠相比，去除垂体的肥大软骨软骨细胞中骨桥蛋白和基质GIA蛋白基因的表达显示出明显的衰减。 3）讨论：骨桥蛋白和基质GIA蛋白在肥大的软骨细胞中在基因水平上表达，这被认为在内软骨骨化中起重要作用，并且已经证实，这些底物蛋白的基因表达在肥大的软骨细胞中会减弱彼得型抚摸的效应，这是彼得的效应。这些发现表明，骨桥蛋白和基质GIA蛋白是与内软骨骨化密切相关的蛋白（目前正在制备中）。我们目前正在使用由大鼠软骨的核心蛋白和X型胶原蛋白的cDNA制成的探针研究肥厚骨软骨细胞的功能变化。