In situハイブリダイゼーション法による肥大軟骨細胞の機能発現の解析

原位杂交法分析肥大软骨细胞的功能表达

基本信息

批准号：
05771490
负责人：
横瀬敏志
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Showa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05771490/
关键词：
軟骨内骨化肥大軟骨細胞基質蛋白 in situハイブリダイゼーション

项目摘要

軟骨内骨化のメカニズムを探る目的で、ラット肥大軟骨細胞における基質蛋白遺伝子の発現をin situハイブリダイゼーション法を用いて調べた。1)材料と方法:正常ラット(8週令)及び下垂体除去ラットの下顎頭と大腿骨を用いて脱灰組織のパラフィン切片を作成しin situハイブリダイゼーション法と免疫組織化学染色を行った。プローブはラット由来のType Iコラーゲン、オステオカルシン、オステオポンチン、マトリックスGIa蛋白のcDNAからDIGを用いて標識した非放射性RNAプローブを用いた。免疫組織化学では、ラットのType Iコラーゲンとオステオカルシンに対するポリクローナル抗体を用いた。2)結果:正常ラットにおける肥大軟骨細胞ではオステオポンチンとマトリックスGIa蛋白の遺伝子発現が見られた。Type Iコラーゲンとオステオカルシンは一次海面骨の骨芽細胞に遺伝子および蛋白の発現が見られたが、肥大軟骨細胞には見られなかった。下垂体除去ラットの肥大軟骨細胞でのオステオポンチンとマトリックスGIa蛋白の遺伝子の発現は正常ラットのものに比べて著しい減弱を示した。3)考察:軟骨内骨化に重要な役割を果たしていると考えられる肥大軟骨細胞に、オステオポンチンとマトリックスGIa蛋白が遺伝子レベルで発現されており、さらに骨格の成長に著しい影響を与える下垂体除去ラットの肥大軟骨細胞では、これらの基質蛋白の遺伝子発現が減弱していることが確認された。これらの所見よりオステオポンチンとマトリックスGIa蛋白は軟骨内骨化と密接に関連した蛋白であることが示唆された(現在投稿準備中)。ラット軟骨のプロテオグリカンのコア蛋白とType XコラーゲンのcDNAより作成したプローブを用いて肥大骨軟骨細胞のものに機能変化を現在検討中である。

为了探讨软骨内骨化的机制，我们利用原位杂交研究了大鼠肥大软骨细胞中基质蛋白基因的表达。 1）材料与方法：采用正常大鼠（8周龄）和垂体切除大鼠的下颌骨髁和股骨制备脱钙组织石蜡切片，进行原位杂交和免疫组化染色。所使用的探针是用DIG标记的非放射性RNA探针，该探针来自大鼠来源的I型胶原蛋白、骨钙素、骨桥蛋白和基质Gla蛋白的cDNA。对于免疫组织化学，使用了针对大鼠 I 型胶原蛋白和骨钙蛋白的多克隆抗体。 2)结果：正常大鼠肥大软骨细胞中观察到骨桥蛋白和基质Gla蛋白的基因表达。在原发性松质骨的成骨细胞中观察到 I 型胶原和骨钙素的基因和蛋白表达，但在肥大软骨细胞中未观察到。与正常大鼠相比，垂体切除大鼠肥大软骨细胞中骨桥蛋白和基质Gla蛋白基因的表达显着减弱。 3）讨论：骨桥蛋白和基质Gla蛋白在肥大软骨细胞中在基因水平上表达，被认为在软骨内骨化中发挥重要作用，垂体切除大鼠的基因表达对骨骼生长有显着影响。这些基质蛋白在肥大软骨细胞中减弱。这些发现表明骨桥蛋白和基质Gla蛋白与软骨内骨化密切相关（目前正在准备提交）。我们目前正在使用由大鼠软骨蛋白聚糖核心蛋白和 X 型胶原蛋白 cDNA 创建的探针来研究肥大骨软骨细胞的功能变化。