ぶどう糖負荷時の培養糸球体内皮細胞における細胞外基質産生とその遺伝子発現について

葡萄糖负荷期间培养的肾小球内皮细胞的细胞外基质产生及其基因表达

• 批准号: 05770840
• 负责人: 高添 一典
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Jikei University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05770840/
• 关键词: 糖尿病性腎症; 糸球体内皮細胞; 細胞外基質; mRNA

糖尿病性腎症の発症進展には高血糖状態が関与していると考えられ、その組織学的特徴としてメサンギウム基質の増加と糸球体基底膜の肥厚が上げられているが、後者の病変の成立については十分な検討がなされておらず、糸球体内皮細胞障害との関連も明らかにされていない。そこで細胞外基質代謝という観点から糸球体内皮細胞の基底膜代謝への関与を考え、培養糸球体内皮細胞を用い以下の検討を行った。ウシの腎より糸球体を単離したのち、Ballermanらの方法に準じて内皮細胞をcloningして培養した。細胞の状態が落ち着いたと思われる継代で、acetyl化LDLの取込み及びfactorVIIIの存在を蛍光直接法にて確認し内皮細胞と同定した。実験には第10継代から第14継代を用いた。まず500mg/dlのぶどう糖を含む培地にて12時間、24時間、48時間培養後、confluentとなった時点で細胞を採取し、非刺激コントロール細胞と比較検討した。Northern blottingによるmRNA発現の検討ではtypeIVcollagen,fibronection,laminin,heparansulphate proteoglycan及びTIMPの発現に両群間で差は認められなかった。そこで次にぶどう糖負荷の時間を延長して発現の差の有無を比較検討したが、3日、5日、7日の負荷においても差は認められなかった。さらにぶどう糖濃度を変化させて行なった検討では、800mg/dlの培養条件下でも500mg/dl負荷群及びコントロール群との差は認められなかった。高糖負荷時の同細胞内ソルビトール含量をHPLCにて測定しpolyol pathwayの動きを観察した。高糖にてソルビトール含量は48時間の糖負荷で増加しaldosereductase inhibitor(ONO-2235)を10^<-5>Mの濃度で高糖培地に添加するとソルビトール合成がおさえられた。今後はメサンギウム細胞、血管内皮細胞を使用して同条件で同様の検討を行ない糸球体内皮細胞の糖尿病性腎症における糸球体基底膜障害への関与の有無をさらに検索する予定である。

高血糖被认为与糖尿病肾病的发展有关，组织学特征包括肾小球基质的增加和肾小球基底膜的增厚，但尚未对后一种病变的建立以及与肾小球内皮细胞损伤的关联。因此，从细胞外基质代谢的角度来看，我们考虑了肾小球内皮细胞在基底膜代谢中的参与，并使用培养的肾小球内皮细胞进行了以下研究。从牛动物的肾脏分离肾小球后，根据Ballerman等人的方法将内皮细胞克隆并培养。在细胞状态似乎已经消退的段落中，通过直接荧光方法确认了乙酰化的LDL的摄取和因子VIII的存在，以鉴定其为内皮细胞。实验中使用了10至14的通道。首先，在含有500 mg/dl葡萄糖的培养基中孵育12、24和48小时后，当细胞汇合并与未刺激的对照细胞进行比较时，收获细胞。当通过北印迹检查mRNA表达时，两组在ivcollagen型，纤维纤维，层粘连蛋白，乙酰硫酸肝素蛋白聚糖和TIMP中的表达中没有观察到差异。接下来，我们延长了葡萄糖加载时间以比较并检查表达是否存在差异，但是即使在第三，第五和第7天的载荷中也没有观察到差异。此外，在通过改变葡萄糖浓度进行的研究中，即使在800 mg/dl的培养条件下，也没有观察到500 mg/dl加载组与对照组之间的差异。通过HPLC测量了高糖负荷下的细胞内山梨糖醇含量，并观察到多元型途径的运动。在48小时的糖负荷下，山梨糖醇含量增加了高糖，当醛糖糖抑制剂抑制剂（ONO-2235）以10^<-5> m的浓度添加到高糖培养基中时，山梨糖醇合成被抑制。将来，我们将在相同条件下使用肾小细胞和血管内皮细胞进行类似的研究，并进一步寻找糖尿病性肾病中肾小球基底膜损伤的存在或不存在。