インフルエンザウイルスRNAポリメラーゼによるウイルスゲノム複製機構の解析

流感病毒RNA聚合酶分析病毒基因组复制机制

• 批准号: 05770220
• 负责人: 豊田 哲也
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05770220/
• 关键词: インフルエンザウイルス; RNAポリメラーゼ; 複製; モデルRNA鋳型; 宿主因子

インフルエンザウイルスは、8本の(-)鎖RNAをゲノムとして持ち、感染した宿主細胞核内でPB1、PB2、PAという3つのサブユニットからなるRNAポリメラーゼを用いて、転写、複製を行なう。これまでにウイルス粒子から精製したRNAポリメラーゼにより、転写についての研究は進んでいたが、ウイルス粒子由来のRNAポリメラーゼでは、複製活性は検出できず、その研究は遅れていた。今回、インフルエンザウイルスゲノムRNAの複製を試験管内で行なわせるために、ゲノム第8分節の両末端を持つ53ヌクレオチドのモデル鋳型を用いて、プライマー非依存性に行なわれるRNA合成を指標にして、ウイルス感染細胞から複製活性を持つRNP画分を抽出した。このRNP画分は、0.5MKClを含むグリセリン濃度勾配遠心にて分画することにより、ジヌクレオチドApG依存性の転写活性は保持したが、複製活性は喪失した。そして、その遠心上清画分又は、非感染細胞核抽出液と混合することにより、ゲノム複製活性を回復した。この0.5MKClを含むグリセリン濃度勾配遠心にて分画した感染細胞RNPには、ウイルス成分として、NPとRNAポリメラーゼのみが存在することが、BioRadの装置を用いたウエスタンブロットにより確認された。以上、インフルエンザウイルスゲノムRNA複製をモデル鋳型を用いて、試験管内で、その全過程を再現し、複製には、感染細胞内におけるNPとRNAポリメラーゼ、及び、宿主細胞由来の因子が、関与していることを明かにした。そして、現在、この因子の同定を行なっている。

流感病毒在基因组中携带8（ - ）链RNA，并使用由感染宿主细胞核中的三个亚基PB1，PB2和PA组成的RNA聚合酶进行转录和复制。转录研究已经通过从病毒颗粒中纯化的RNA聚合酶进行的，但是无法用源自病毒颗粒的RNA聚合酶检测到复制活性，并且该研究延迟了。在本文中，为了在体外复制流感病毒基因组RNA，使用53个核苷酸模型模板具有第8个基因组的两端，使用独立的RNA合成从病毒感染的细胞中提取具有复制活性的RNP级分。通过含0.5 MKCL的甘油浓度梯度离心分离此RNP级分，尽管保留了二核苷酸APG依赖性转录活性，但丢失了复制活性。然后，通过将离心上清液分数或未感染的细胞核提取物混合来恢复基因组复制活性。使用Biorad设备的蛋白质印迹证实，被感染的细胞RNP通过甘油浓度梯度离心分离，含有0.5 MKCL仅包含NP和RNA聚合酶作为病毒成分。在体外使用模型模板在体外重现了上述复制流感病毒基因组RNA的方法，并揭示了NPS，受感染细胞中的NPS，RNA聚合酶以及从宿主细胞中得出的因子涉及复制。现在，正在确定这个因素。