インフルエンザウイルスRNAポリメラーゼによるウイルスゲノム複製機構の解析

流感病毒RNA聚合酶分析病毒基因组复制机制

• 批准号: 05770220
• 负责人: 豊田 哲也
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05770220/
• 关键词: インフルエンザウイルス; RNAポリメラーゼ; 複製; モデルRNA鋳型; 宿主因子

インフルエンザウイルスは、8本の(-)鎖RNAをゲノムとして持ち、感染した宿主細胞核内でPB1、PB2、PAという3つのサブユニットからなるRNAポリメラーゼを用いて、転写、複製を行なう。これまでにウイルス粒子から精製したRNAポリメラーゼにより、転写についての研究は進んでいたが、ウイルス粒子由来のRNAポリメラーゼでは、複製活性は検出できず、その研究は遅れていた。今回、インフルエンザウイルスゲノムRNAの複製を試験管内で行なわせるために、ゲノム第8分節の両末端を持つ53ヌクレオチドのモデル鋳型を用いて、プライマー非依存性に行なわれるRNA合成を指標にして、ウイルス感染細胞から複製活性を持つRNP画分を抽出した。このRNP画分は、0.5MKClを含むグリセリン濃度勾配遠心にて分画することにより、ジヌクレオチドApG依存性の転写活性は保持したが、複製活性は喪失した。そして、その遠心上清画分又は、非感染細胞核抽出液と混合することにより、ゲノム複製活性を回復した。この0.5MKClを含むグリセリン濃度勾配遠心にて分画した感染細胞RNPには、ウイルス成分として、NPとRNAポリメラーゼのみが存在することが、BioRadの装置を用いたウエスタンブロットにより確認された。以上、インフルエンザウイルスゲノムRNA複製をモデル鋳型を用いて、試験管内で、その全過程を再現し、複製には、感染細胞内におけるNPとRNAポリメラーゼ、及び、宿主細胞由来の因子が、関与していることを明かにした。そして、現在、この因子の同定を行なっている。

流感病毒的基因组有八条RNA负链，并使用RNA聚合酶在受感染宿主细胞的细胞核内转录和复制，RNA聚合酶由三个亚基组成：PB1、PB2和PA。迄今为止，利用从病毒颗粒纯化的RNA聚合酶进行转录的研究取得了进展，但利用源自病毒颗粒的RNA聚合酶无法检测复制活性，研究被推迟。这次，为了在体外复制流感病毒基因组RNA，我们使用了具有第8基因组片段两端的53核苷酸模型模板，并以不依赖引物的RNA合成为指标，从中提取了具有复制活性的RNP级分。被感染的细胞。当使用含有0.5M KCl的甘油浓度梯度离心分离该RNP级分时，保留了二核苷酸ApG依赖性转录活性，但复制活性丢失。通过与离心的上清液部分或未感染的细胞核提取物混合来恢复基因组复制活性。使用BioRad装置通过Western印迹证实，通过含有0.5MKCl的甘油浓度梯度离心分离的感染细胞RNP中仅NP和RNA聚合酶作为病毒成分存在。如上所述，我们利用模型模板在体外再现了流感病毒基因组RNA复制的整个过程，发现感染细胞中的NP和RNA聚合酶以及宿主细胞来源的因子参与了复制。我们目前正在确定这个因素。