魚類シトクロムP-450cDNAを用いた環境汚染判定法の開発

鱼类细胞色素P-450 cDNA测定环境污染方法的建立

• 批准号: 05760165
• 负责人: 大嶋 雄治
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05760165/
• 关键词: P-450; 環境汚染; 指標; 魚; DNA; PCR

マコガレイP-450遺伝子の増幅:既に塩基配列の判明しているウナギP-450遺伝子の情報を基に、PCRプライマーを作制した。次いでマコガレイ肝臓より全DNAを抽出し、cDNAを鋳型としてPCRによりP-450遺伝子を増幅したが、目的の遺伝子は増幅しなかった。本原因として、P-450をコードする遺伝子の中に、イントロン(非翻訳部分)があるため、増幅されなかったと考えられた。よって、生きたウナギの肝臓よりmRNAを抽出後、DNAに逆転写を行った後、PCR(RT-PCR)を行った結果、約300bps付近にDNAが増幅された。よって、このDNAを精製し、ダイレクトシーケンス法によりその塩基配列を決定した。環境調査: 九州北部博多湾内で、汚染された水域および清浄な水域よりマコガレイを計10個体釣りにより採取した。肝臓は現場で直ちに抽出して液体窒素で凍結、-80℃で保存した。肝臓の細胞分画を行い、P-450含量とその酵素活性を測定した結果、P-450含量およびP-450によって触媒されるbenzo[a]pyrene hydroxylaseの活性は、汚染魚で対象魚にくらべ有意(p<0.01)に高かった。しかし、肝臓よりmRNAを抽出しRT-PCRを行ったが目的とするDNAは検出されなかった。以上の結果より、汚染されたマコガレイの肝臓におけるP-450含量は高く、誘導が起こっていたと考えられる。また、P-450のmRNAが検出されなかった原因は採集、凍結、保存(-80度)時にmRNAが分解されたと推定された。本研究の結果、環境汚染によるマコガレイのP-450の誘導が明らかとなった。今後は、再度マコガレイの採取を行い、生きた魚よりmRNAを抽出、RT-PCRによってP-450mRNAの発現を明らかにして行く予定である。

比目鱼P-450基因的扩增：根据已知碱基序列的鳗鱼P-450基因的信息制作PCR引物。接下来，从比目鱼的肝脏中提取总DNA，并以cDNA为模板通过PCR扩增P-450基因，但目的基因没有扩增。其原因被认为是编码P-450的基因含有内含子（非翻译部分），因此没有被扩增。因此，从活鳗鱼的肝脏中提取mRNA，逆转录为DNA后，进行PCR(RT-PCR)，结果DNA被扩增至约300bp。因此，纯化该DNA并通过直接测序确定其核苷酸序列。环境调查：在九州北部博多湾的污染水域和清洁水域中采集了总共10条鲽鱼个体。立即现场提取肝脏，冷冻在液氮中，并保存在-80°C。通过进行肝细胞分级分离并测量 P-450 含量及其酶活性，我们发现受污染的鱼中 P-450 含量和 P-450 催化的苯并[a]芘羟化酶活性显着低于在目标鱼中显着较高（p<0.01）。然而，当从肝脏中提取mRNA并进行RT-PCR时，没有检测到目标DNA。从以上结果可以认为，受污染的比目鱼肝脏中的P-450含量高，并且正在发生诱导。还推测未检测到P-450 mRNA的原因是mRNA在收集、冷冻和储存（-80度）过程中被降解。这项研究的结果表明，环境污染会在鲽鱼中诱导P-450。今后，我们计划再次采集比目鱼，从活鱼中提取mRNA，并利用RT-PCR来阐明P-450 mRNA的表达。