アクチン結合によるミオシンのATP分解部位の構造変化

肌动蛋白结合导致肌球蛋白 ATP 降解位点的结构变化

• 批准号: 03640613
• 负责人: 山本 啓一
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Soka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03640613/
• 关键词: 筋収縮; ミオシン; ATP

本研究の目的は(1)ミオシンのATP分解部位とアクチン結合部位の位置関係と(2)アクチン結合によるATP分解部位の構造変化を明らかにする事である。そのためにATPを嵩ばったものに繋いでアクチンと結合したミオチン分解させるといった方法をとった。嵩ばったものとしては,非常に反応性の高いSH基を1個だけ持つコウジカビのアミラ-ゼ(分子量約5万)を用い,そのSH基にアミノヘキシルカルバモイルメチルATPを二価性架橋試薬,サクシニミジル4ー[Pーマレイミドフェニル]ブチレイトによって結合させた。未反応の試薬はゲル滬過法によって除去し,アミラ-ゼATPはDEAEイオン交換カラムを使った高速液体クロマトグラフィ-によって精製し,限外滬過法によって濃縮してから使用した。タンパク質濃度とリン酸含量とからこの物質がアミラ-ゼとATPの1対1結合物であることを確めた上でミオシン及びアクトミオシンに分解させた。結果は予期に反し,ミオシンによる分解速度とアクトミオシンによる分解速度があまり変わらなかった。この反応条件下ではアクトミオシンの方が数十倍活性が高いはずであるのにそうならないのはアクチンがアミラ-ゼと結合したATPの接合を妨げているためではないかと考えられた。そこで,アミラ-ゼとATPを繋いでいる鎖(ジアミノヘキサン)をジアミノブタンやエチレンジアミンに替えて短くしたところさらにアクトミオシンのATP分解活性が下ったので上記の推察が正しいという事が確められた。ATP結合部位とアクチン結合部位はかなり近いのではないかと思われる。

本研究的目的是阐明（1）肌球蛋白的ATP降解位点与肌动蛋白结合位点之间的位置关系，以及（2）肌动蛋白结合导致的ATP降解位点的结构变化。为了做到这一点，他们使用了一种方法，将 ATP 与大块物质结合在一起，并导致与肌动蛋白结合的肌动蛋白分解。作为大体积产品，使用仅具有一个高反应性SH基团的曲霉淀粉酶(分子量约50,000)，并在SH基团上添加氨基己基氨基甲酰甲基ATP作为二价交联剂，通过4个琥珀酰亚胺进行偶联。 -[对马来酰亚胺苯基]丁酸酯。通过凝胶过滤除去未反应的试剂，并使用DEAE离子交换柱通过高效液相色谱纯化淀粉酶ATP并在使用前通过超滤浓缩。从蛋白质浓度和磷酸含量确认这种物质是淀粉酶和ATP一一结合后，分解为肌球蛋白和肌动球蛋白。结果表明，与预期相反，肌球蛋白和肌动球蛋白的降解率没有显着差异。尽管在这些反应条件下肌动球蛋白的活性应该高出几十倍，但人们认为情况并非如此，因为肌动蛋白阻止了与淀粉酶结合的ATP的结合。因此，当连接淀粉酶和ATP（二氨基己烷）的链被二氨基丁烷或乙二胺取代而缩短时，肌动球蛋白的ATP降解活性进一步降低，证实了上述推测是正确的。看来 ATP 结合位点和肌动蛋白结合位点非常接近。