アクチン結合によるミオシンのATP分解部位の構造変化

肌动蛋白结合导致肌球蛋白 ATP 降解位点的结构变化

• 批准号: 03640613
• 负责人: 山本 啓一
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Soka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03640613/
• 关键词: 筋収縮; ミオシン; ATP

本研究の目的は(1)ミオシンのATP分解部位とアクチン結合部位の位置関係と(2)アクチン結合によるATP分解部位の構造変化を明らかにする事である。そのためにATPを嵩ばったものに繋いでアクチンと結合したミオチン分解させるといった方法をとった。嵩ばったものとしては,非常に反応性の高いSH基を1個だけ持つコウジカビのアミラ-ゼ(分子量約5万)を用い,そのSH基にアミノヘキシルカルバモイルメチルATPを二価性架橋試薬,サクシニミジル4ー[Pーマレイミドフェニル]ブチレイトによって結合させた。未反応の試薬はゲル滬過法によって除去し,アミラ-ゼATPはDEAEイオン交換カラムを使った高速液体クロマトグラフィ-によって精製し,限外滬過法によって濃縮してから使用した。タンパク質濃度とリン酸含量とからこの物質がアミラ-ゼとATPの1対1結合物であることを確めた上でミオシン及びアクトミオシンに分解させた。結果は予期に反し,ミオシンによる分解速度とアクトミオシンによる分解速度があまり変わらなかった。この反応条件下ではアクトミオシンの方が数十倍活性が高いはずであるのにそうならないのはアクチンがアミラ-ゼと結合したATPの接合を妨げているためではないかと考えられた。そこで,アミラ-ゼとATPを繋いでいる鎖(ジアミノヘキサン)をジアミノブタンやエチレンジアミンに替えて短くしたところさらにアクトミオシンのATP分解活性が下ったので上記の推察が正しいという事が確められた。ATP結合部位とアクチン結合部位はかなり近いのではないかと思われる。

这项研究的目的是阐明（1）肌球蛋白ATP降解位点和肌动蛋白结合位点之间的位置关系，以及（2）由于肌动蛋白结合而引起的ATP降解位点的结构变化。为此，ATP连接到了笨重的产品，并进行了肌蛋白分解。 The bulky was the amylase (molecular weight about 50,000) of the saccharide fungus, which has only one highly reactive SH group, and aminohexylcarbamoylmethylATP was attached to the SH group by the divalent crosslinking reagent, succinimidyl 4-[Pmaleimidephenyl]butyrate.通过凝胶过载去除未反应的试剂，并使用DEAE离子交换柱通过高性能液相色谱纯化淀粉酶ATP，并在使用前通过超过载来浓缩。蛋白质浓度和磷酸盐含量证实，该材料是淀粉酶和ATP的一对一结合物，然后将其降解为肌球蛋白和肌动蛋白。结果与预期的结果相反，肌球蛋白和肌动蛋白的降解率没有太大差异。据认为，在这些反应条件下，肌动球蛋白应该要活跃几十倍，但这并没有发生，因为肌动蛋白可以防止与淀粉酶结合的ATP结合。因此，当连接淀粉酶和ATP（二氨基己烷）的链条通过替换二氨基丁烷或乙二胺的缩短时，肌动蛋白的ATP降解活性进一步降低，这清楚地表明上述推测是正确的。看来ATP结合位点和肌动蛋白结合位点非常相似。