新しいイノシト-ル1,4,5ー三リン酸結合蛋白に関する生化学的研究

新型肌醇1,4,5-三磷酸结合蛋白的生化研究

基本信息

批准号：
03670126
负责人：
平田雅人
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03670126/
关键词：
IP_3アナログ IP_3親和性カラム IP_3結合蛋白

项目摘要

イノシト-ル1,4,5ー三リン酸(IP_3)は細胞内小胞体の含有するCa^<2+>を放出させることにより,細胞内情報伝達系の重要な一翼を担っている。我々は一昨年来,細胞内でIP_3を認識する蛋白質(小胞体上のIP_3受容体やIP_3代謝酵素)の活性中心の構造を調べるため一連のIP_3アナログを化学合成し,IP_3認識蛋白に対する影響を検討してきた。その一連の流れの中でIP_3親和性カラムも作製した。本研究では,このIP_3親和性カラムを用いた研究を遂行し以下の結果を得た。ラット大脳可溶性分画をIP_3カラムにアプライし,2MーNaClを含む溶液で溶出するとIP_3代謝活性を有しないのに強いIP_3結合活性のあることがわかった。この分画をゲルロ過クロマトグラフィ-によりさらに分画すると,分子量130kDaと85kDaの両蛋白が強いIP_3結合活性を担っていた。濃縮してそれぞれの精製蛋白を得た。両蛋白とも結合はIP_3に対して特異的で,かつ1〜3nM程度の高い親和性を有していた。精製蛋白をリジルエンドペプチダ-ゼで限定分解の後,疎水性クロマトグラフィ-により分画した。それぞれ得られた3種のペプチドのアミノ酸配列夜求め,SwissーProtデ-タベ-スでホモロジ-検索を行なった。130kDaの蛋白に類似した蛋白は見い出せなかったが一方,85kDaの蛋白はホスホリパ-ゼC(PLC)のδ型アイソザイムと同じであった。130kDaの蛋白の作用は現在のところ全く不明である。85kDaのPLCδがIP_3結合活性を有していたことから,IP_3のPLCδ活性に及ぼす影響を調べた。その結果,IP_3はμMの濃度範囲でPLCδ活性を抑制することがわかった。生理的には細胞内のIP_3濃度はμMレベルで変化することが知られており,この抑制は生理的意義のあることかもしれない。これら両IP_3結合蛋白とも可溶性分画のみならず,膜分画の界面活性剤による抽出液中からもほぼ同様の技法で精製された。

肌醇1,4,5-三磷酸(IP_3)通过释放细胞内内质网中含有的Ca 2+ ，在细胞内信号转导系统中发挥重要作用。两年前，我们化学合成了一系列IP_3类似物，研究细胞内识别IP_3的蛋白质活性中心（内质网上的IP_3受体和IP_3代谢酶）的结构，并考察了它们对IP_3识别蛋白I的影响。已经做到了。作为此过程的一部分，我们还创建了 IP_3 亲和柱。在本研究中，我们使用IP_3亲和柱进行了研究，并获得了以下结果。当将大鼠脑可溶级分上样至IP_3柱并用含有2M-NaCl的溶液洗脱时，发现其不具有IP_3代谢活性，但具有较强的IP_3结合活性。通过凝胶流色谱对该级分的进一步分级显示，分子量为 130kDa 和 85kDa 的两种蛋白质均具有强 IP_3 结合活性。通过浓缩获得每种纯化的蛋白质。两种蛋白的结合对 IP_3 具有特异性，并且具有约 1 至 3 nM 的高亲和力。用赖氨酰内肽酶进行有限消化后，通过疏水色谱法对纯化的蛋白质进行分级。确定了获得的三种肽的氨基酸序列，并在Swiss-Prot数据库上进行同源性搜索。没有发现与130 kDa蛋白相似的蛋白，而85 kDa蛋白与磷脂酶C（PLC）的δ型同工酶相同。 130kDa 蛋白质的作用目前完全未知。由于85kDa PLCδ具有IP_3结合活性，我们研究了IP_3对PLCδ活性的影响。结果表明，IP_3在μM浓度范围内抑制PLCδ活性。生理学上，已知细胞内IP_3浓度在μM水平上变化，这种抑制可能具有生理意义。使用几乎相同的技术，这两种IP_3结合蛋白不仅从可溶性级分中纯化，而且从膜级分的表面活性剂提取物中纯化。