Zymomonas細菌の糖代謝酵素の解析と利用

发酵单胞菌糖代谢酶的分析及利用

• 批准号: 03660114
• 负责人: 簗瀬 英司
• 金额: --
• 依托单位: Tottori University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03660114/
• 关键词: アルコ-ル発酵; オキシドレダクタ-ゼ; オリゴ糖; 糖転移; フルクトシルトランスフェラ-ゼ; レバンスクラ-ゼ; Zymomonas mobilis

アルコ-ル発酵性細菌であるZymomonas mobilisはユニ-クな糖代謝系を有しており、そのために酸母よりも優れたアルコ-ル生産性を示す。本研究では、Z.mobilisに見いだした糖転移酵素、フルクトシルトランスフェラ-ゼ(FTase)や糖酸化還元酵素、グルコ-ス・フルクト-スオキシドレダクタ-ゼ(GFORase)を利用した機能性糖質化合物合成を目的とした。本年度は、FTaseによるオリゴ糖合成の検討、およびFTaseの糖転移反応改変のためのFTase遺伝子のクロ-ニングを行った。以下に、研究成果をまとめる。1)FTaseの反応特性:FTaseをZ.mobilisの粗酵素液より硫安分画、DEAEーToyopearl、Toyopearl HW55カラムクロマトグラフィ-の後に、硫安を添加することにより、結晶状に単離した。得られた結晶標品を用いて物理化学的および酵素化学的性質を明らかにした。また、FTaseが広い糖転移受容体特異性を示すことから、ヘテロフルクトオリゴ糖合成の触媒素子として利用できるを明らかにした。2)FTase遺伝子のクロ-ニング:エドマン分解により決定したFTーase Nー末端アミノ酸20残基の配列をもとに塩基配列を推定してオリゴヌクレオチドプロ-ブを合成した。次に、Z.mobilisのゲノムライブラリ-より、合成オリゴヌクレオチドをプロ-ブとしたDNAーDNAハイブリダイゼ-ション法によりFTase遺伝子を担う約3.4kbーCNA断片を分離した。3)FTase遺伝子の解析:約3.4kbーDNA断片の全塩基配列を決定した。その結果、FTase遺伝子と推定されるアミノ酸424残基からなる1269bpsのオ-プンリ-ディングフレ-ムを見いだした。塩基配列より推定したNー末端アミノ酸配列はFTase酵素タンパクの分析値と一致した。現在、FTaseの糖転移反応機構の解析と改変を目的として、FTase遺伝子への部位への部位特異的変異導入を検討している。

Zymomonas mobilis是一种可酒精发酵细菌，具有独特的糖代谢系统，比酸母亲的酒精生产力更好。这项研究旨在使用糖基转移酶，果糖基转移酶（FTase），糖基氧化酶酶和葡萄糖 - 果糖氧化还原酶（GFORASE）合成功能性碳水化合物化合物。今年，我们通过FTase研究了寡糖合成，并克隆了FTase基因，以改变FTase的糖基化反应。研究结果总结为下面。 1）FTase的反应特征：通过添加硫酸铵分馏，Deae-Toyopearl，Toyopearl HW55柱色谱，然后添加硫酸铵。所得的晶体制剂用于阐明物理化学和酶促化学特性。此外，由于FTase表现出广泛的转糖基化受体特异性，因此已经表明它可以用作杂种果糖合成的催化装置。 2）通过基于通过Edman降解确定的20 FTase N末端氨基酸的序列来确定基本序列，通过推论基本序列来合成FTase基因的克隆：寡核苷酸探针。接下来，使用合成寡核苷酸作为探针，通过DNA-DNA杂交从Z.mobilis基因组文库中分离出大约3.4 kb的CNA片段与Z.mobilis基因组文库分离。 3）对FTase基因的分析：DNA片段的总碱基序列在大约3.4 kb下确定。结果，我们发现了一个开放式检索框架为1269 bps，由424个氨基酸残基组成，这些氨基酸残基被认为是FTase基因。从碱基序列估计的N末端氨基酸序列与FTase酶蛋白的分析值一致。目前，我们正在考虑将定位的诱变转向FTase基因，目的是分析和修改FTase的糖基化反应机制。

项目成果

H.Yanase et al.: "Purification,crystallization,and properties of the extracellular levansucrase from Zymomonas mobilis" Biosci.Biotech.Biochem.

H.Yanase 等人：“运动发酵单胞菌胞外果聚糖蔗糖酶的纯化、结晶和特性”Biosci.Biotech.Biochem。

H.Yanase et al.: "Metabolism of galactose in Zymomonas mobilis" Appl.Microbiol.Biotechnol.35. 364-368 (1991)

H.Yanase 等人：“运动发酵单胞菌中半乳糖的代谢”Appl.Microbiol.Biotechnol.35。

H.Yanase et al.: "Cloning,sequencing,and characterization of the intracellular invertase gene from Zymomonas mobilis" Agric.Biol.Chem.,. 55. 1383-1390 (1991)

H.Yanase 等人：“运动发酵单胞菌胞内转化酶基因的克隆、测序和表征”Agric.Biol.Chem.,。