Zymomonas細菌の糖代謝酵素の解析と利用

发酵单胞菌糖代谢酶的分析及利用

• 批准号: 03660114
• 负责人: 簗瀬 英司
• 金额: --
• 依托单位: Tottori University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03660114/
• 关键词: アルコ-ル発酵; オキシドレダクタ-ゼ; オリゴ糖; 糖転移; フルクトシルトランスフェラ-ゼ; レバンスクラ-ゼ; Zymomonas mobilis

アルコ-ル発酵性細菌であるZymomonas mobilisはユニ-クな糖代謝系を有しており、そのために酸母よりも優れたアルコ-ル生産性を示す。本研究では、Z.mobilisに見いだした糖転移酵素、フルクトシルトランスフェラ-ゼ(FTase)や糖酸化還元酵素、グルコ-ス・フルクト-スオキシドレダクタ-ゼ(GFORase)を利用した機能性糖質化合物合成を目的とした。本年度は、FTaseによるオリゴ糖合成の検討、およびFTaseの糖転移反応改変のためのFTase遺伝子のクロ-ニングを行った。以下に、研究成果をまとめる。1)FTaseの反応特性:FTaseをZ.mobilisの粗酵素液より硫安分画、DEAEーToyopearl、Toyopearl HW55カラムクロマトグラフィ-の後に、硫安を添加することにより、結晶状に単離した。得られた結晶標品を用いて物理化学的および酵素化学的性質を明らかにした。また、FTaseが広い糖転移受容体特異性を示すことから、ヘテロフルクトオリゴ糖合成の触媒素子として利用できるを明らかにした。2)FTase遺伝子のクロ-ニング:エドマン分解により決定したFTーase Nー末端アミノ酸20残基の配列をもとに塩基配列を推定してオリゴヌクレオチドプロ-ブを合成した。次に、Z.mobilisのゲノムライブラリ-より、合成オリゴヌクレオチドをプロ-ブとしたDNAーDNAハイブリダイゼ-ション法によりFTase遺伝子を担う約3.4kbーCNA断片を分離した。3)FTase遺伝子の解析:約3.4kbーDNA断片の全塩基配列を決定した。その結果、FTase遺伝子と推定されるアミノ酸424残基からなる1269bpsのオ-プンリ-ディングフレ-ムを見いだした。塩基配列より推定したNー末端アミノ酸配列はFTase酵素タンパクの分析値と一致した。現在、FTaseの糖転移反応機構の解析と改変を目的として、FTase遺伝子への部位への部位特異的変異導入を検討している。

运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）是一种酒精发酵细菌，具有独特的糖代谢系统，因此与酸载体相比表现出优异的酒精生产率。在这项研究中，我们利用运动发酵单胞菌中发现的糖基转移酶、果糖基转移酶 (FTase)、糖氧化还原酶和葡萄糖果糖氧化还原酶 (GFORase) 开发了功能性糖基转移酶，目的是合成优质化合物。今年，我们研究了 FTase 合成寡糖的方法，并克隆了 FTase 基因来修饰 FTase 转糖基反应。研究结果总结如下。 1) FTase的反应特性：通过硫酸铵分级、DEAE-Toyopearl、Toyopearl HW55柱层析、添加硫酸铵，从运动发酵单胞菌粗酶液中分离出结晶形式的FTase。阐明了所得晶体制剂的理化和酶学性质。我们还证明 FTase 可以用作异低聚果糖合成的催化元件，因为它表现出广泛的糖基转移受体特异性。 2)FTase基因的克隆：根据Edman降解确定的FTase N端20个氨基酸残基的序列，估计碱基序列并合成寡核苷酸探针。接下来，使用合成寡核苷酸作为探针，通过DNA-DNA杂交从运动发酵单胞菌基因组文库中分离出携带FTase基因的约3.4kb CNA片段。 3)FTase基因分析：确定约3.4kb DNA片段的完整碱基序列。结果，我们发现了一个由424个氨基酸残基组成的1269bps的开放阅读框，推测这就是FTase基因。由核苷酸序列推导的N端氨基酸序列与FTase酶蛋白的分析值一致。目前，我们正在研究在FTase基因中引入位点特异性突变，旨在分析和修改FTase转糖基反应机制。

项目成果

H.Yanase et al.: "Purification,crystallization,and properties of the extracellular levansucrase from Zymomonas mobilis" Biosci.Biotech.Biochem.

H.Yanase 等人：“运动发酵单胞菌胞外果聚糖蔗糖酶的纯化、结晶和特性”Biosci.Biotech.Biochem。

H.Yanase et al.: "Metabolism of galactose in Zymomonas mobilis" Appl.Microbiol.Biotechnol.35. 364-368 (1991)

H.Yanase 等人：“运动发酵单胞菌中半乳糖的代谢”Appl.Microbiol.Biotechnol.35。

H.Yanase et al.: "Cloning,sequencing,and characterization of the intracellular invertase gene from Zymomonas mobilis" Agric.Biol.Chem.,. 55. 1383-1390 (1991)

H.Yanase 等人：“运动发酵单胞菌胞内转化酶基因的克隆、测序和表征”Agric.Biol.Chem.,。