遺伝子破壊法による酵母プロテアソ-ム(巨大蛋白分解酵素複合体)の機能解析

通过基因破坏法对酵母蛋白酶体（巨型蛋白酶复合物）进行功能分析

基本信息

批准号：
02680137
负责人：
田中啓二
金额：
$ 1.02万
依托单位：
The University of Tokushima
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

プロテアソ-ムは真核生物に普遍的に存在する巨大な多成分複合体であり、この新種の細胞内プロテア-ゼの生物機能を解明する為に本研究では酵母系を用いて分子遺伝学的解析を行った。酵母プロテアソ-ムを構成する3種のサブユニットのcDNAをクロ-ニングし、これらの遺伝子をPRS1,2,3と名付けた。PRS1遺伝子の機能を解明する為、その翻訳領域と5'ー非翻訳領域でマ-カ-遺伝子の挿入破壊を行った。四分子分析の結果、翻訳領域での染色体遺伝子の破壊の場合にのみ劣性致死効果を示し、栄養素要求性解析サザンブロット分析の結果も遺伝子の欠失が証明された。またPRS2及びPRS3の遺伝子破壊も同様な劣性致死効果を示した。これらの結果、即ちプロテアソ-ムを構成する3種類のサブユニットの各々が細胞の生存・増殖に必須であることは、個々のサブユニットの各々が機能的に重要で必須であると言うよりも寧ろ、多成分複合体としてのプロテアソ-ムの機能が生理的に重要であることを示唆している。恐らく、各々のサブユニットの染色体遺伝子の破壊による欠損は正常なプロテアソ-ム複合体の構造維持や機能発現に支障を来し、その故に細胞の増殖が停止したと想定される。本研究で得られた結果はこの巨大な分子集合体であるプロテアソ-ムが細胞にとって不可欠な生理機能を担っていることを直接的に証明したことを意味している。現在、このプロテアソ-ムの必須性の分子機構を解明する為に、誘導制御の可能なGALプロモ-タ-をPRS1遺伝子の5'ー上流領域に連絡し、この遺伝子の発現制御に基づいて細胞周期が停止し、死に至る機構を解析しつつある。この細胞増殖の停止機構を解析することによって、逆にプロテアソ-ムの正常な機能を解明する計画である。これらの酵母系での分子遺伝学的研究はプロテアソ-ムの生理機能解析に最も強力で且つ、有力な実験系と思われる。

蛋白酶是一种巨大的多组分复合物，在真核生物中普遍存在，在这项研究中，使用酵母系统进行了分子遗传分析，以阐明这种新的细胞内蛋白酶的生物学功能。克隆了构成酵母菌蛋白酶的三个亚基的cDNA，这些基因命名为PRS1,2,3。为了阐明PRS1基因的功能，在翻译区域和5'-非翻译区域中，MACA基因的插入被破坏。四分子分析的结果仅在转化区域染色体基因中断的情况下才显示隐性致死作用，而生长素营养分析的结果Southern Southern印迹分析的结果也证明了基因缺失。此外，PRS2和PRS3的基因破坏也显示出类似的隐性致命作用。这些结果表明，构成蛋白酶的三个亚基中的每一个对于细胞存活和增殖都是必不可少的，而不是每个单个亚基在功能上很重要且必不可少的事实，生理上重要的是，蛋白酶作为多组分复合物的功能是。假定由于每个亚基中染色体基因的破坏引起的缺陷将干扰正常蛋白酶体复合物的结构和功能表达，这将导致阻止细胞增殖。在这项研究中获得的结果意味着，这种巨大的分子组装蛋白酶体直接表明它对于细胞至关重要。目前，为了阐明该蛋白酶体的基本分子机制，将能够诱导控制的GAL启动子与PRS1基因的5'上游区域接触，并根据该基因的表达控制对细胞周期捕捉并分析死亡的机制。通过分析细胞增殖停滞的机制，该计划是阐明蛋白酶的正常功能。这些酵母系统中的分子遗传研究可能是分析蛋白酶生理功能的最强大和强大的实验系统。