遺伝子破壊法による酵母プロテアソ-ム(巨大蛋白分解酵素複合体)の機能解析

通过基因破坏法对酵母蛋白酶体（巨型蛋白酶复合物）进行功能分析

基本信息

批准号：
02680137
负责人：
田中啓二
金额：
$ 1.02万
依托单位：
The University of Tokushima
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

プロテアソ-ムは真核生物に普遍的に存在する巨大な多成分複合体であり、この新種の細胞内プロテア-ゼの生物機能を解明する為に本研究では酵母系を用いて分子遺伝学的解析を行った。酵母プロテアソ-ムを構成する3種のサブユニットのcDNAをクロ-ニングし、これらの遺伝子をPRS1,2,3と名付けた。PRS1遺伝子の機能を解明する為、その翻訳領域と5'ー非翻訳領域でマ-カ-遺伝子の挿入破壊を行った。四分子分析の結果、翻訳領域での染色体遺伝子の破壊の場合にのみ劣性致死効果を示し、栄養素要求性解析サザンブロット分析の結果も遺伝子の欠失が証明された。またPRS2及びPRS3の遺伝子破壊も同様な劣性致死効果を示した。これらの結果、即ちプロテアソ-ムを構成する3種類のサブユニットの各々が細胞の生存・増殖に必須であることは、個々のサブユニットの各々が機能的に重要で必須であると言うよりも寧ろ、多成分複合体としてのプロテアソ-ムの機能が生理的に重要であることを示唆している。恐らく、各々のサブユニットの染色体遺伝子の破壊による欠損は正常なプロテアソ-ム複合体の構造維持や機能発現に支障を来し、その故に細胞の増殖が停止したと想定される。本研究で得られた結果はこの巨大な分子集合体であるプロテアソ-ムが細胞にとって不可欠な生理機能を担っていることを直接的に証明したことを意味している。現在、このプロテアソ-ムの必須性の分子機構を解明する為に、誘導制御の可能なGALプロモ-タ-をPRS1遺伝子の5'ー上流領域に連絡し、この遺伝子の発現制御に基づいて細胞周期が停止し、死に至る機構を解析しつつある。この細胞増殖の停止機構を解析することによって、逆にプロテアソ-ムの正常な機能を解明する計画である。これらの酵母系での分子遺伝学的研究はプロテアソ-ムの生理機能解析に最も強力で且つ、有力な実験系と思われる。

蛋白酶体是真核生物中普遍存在的一种巨大的多组分复合物，为了阐明这种新型细胞内蛋白酶的生物学功能，本研究将利用酵母系统进行分子遗传学分析。我们克隆了组成酵母蛋白酶体的三个亚基的cDNA，并将这些基因命名为PRS1、2、3。为了阐明 PRS1 基因的功能，我们在其翻译区和 5'-非翻译区插入并破坏了标记基因。四分体分析结果显示，仅在翻译区染色体基因破坏的情况下才具有隐性致死效应，营养缺陷型Southern印迹分析结果也显示基因缺失。 PRS2 和 PRS3 的基因破坏也表现出类似的隐性致死效应。这些结果表明，组成蛋白酶体的三种类型的亚基中的每一种对于细胞存活和增殖都是必需的，而不是说每个单独的亚基在功能上都是重要和必需的，而是表明蛋白酶体作为多组分的功能。复合体在生理上很重要。据推测，由每个亚基的染色体基因破坏引起的缺陷阻碍了蛋白酶体复合物正常结构和功能表达的维持，并且细胞增殖因此停止。这项研究获得的结果直接证明了蛋白酶体这个巨大的分子组装体对细胞起着至关重要的生理功能。目前，为了阐明蛋白酶体不可或缺的分子机制，我们将诱导型和可控型GAL启动子连接到PRS1基因的5'上游区域，目前正在分析循环停止和死亡的机制。发生。通过分析阻止细胞增殖的机制，我们计划阐明蛋白酶体的正常功能。使用这些酵母系统进行的分子遗传学研究被认为是分析蛋白酶体生理功能的最强大和最有效的实验系统。